Desafíos de la pluripotencia y la reprogramación celular : obstáculos en una especie refractaria y organización dinámica de los factores de transcripción Oct4 y Sox2

Institución otorgante:

Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Fecha:

2020-12-04

Tipo de documento: 

info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
 

Formato:

application/pdf

Idioma:

spa

Temas:

CELULAS MADRE EMBRIONARIAS - CELULAS MADRE PLURIPOTENTES INDUCIDAS - PLURIPOTENCIA - DIFERENCIACION - REPROGRAMACION - DISTRIBUCION SUBNUCLEAR - DINAMICA DE INTERACCION - EMBRYONIC STEM CELLS - INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS - PLURIPOTENCY - DIFFERENTIATION - REPROGRAMMING - SUBNUCLEAR DISTRIBUTION - DYNAMICAL INTERACTION

Descripción:

Las células madre embrionarias (CME) derivan del macizo celular interno del blastocisto y presentan dos características únicas: poder auto-renovarse indefinidamente en cultivo y dar lugar a todos los tipos celulares del organismo adulto, propiedad conocida como pluripotencia. Por otro lado, es posible reprogramar células terminalmente diferenciadas obteniendo así células madre pluripotentes (CMP) inducidas (CMPI), muy similares a las CME. Las CMP son utilizadas actualmente en diversas áreas de estudio como biología del desarrollo, biotecnología y medicina regenerativa. Sin embargo, aún no se han logrado establecer líneas de CMP para algunas especies de interés biotecnológico como, por ejemplo, el bovino. En este trabajo nos propusimos contribuir al entendimiento de los mecanismos moleculares relevantes en el mantenimiento de la pluripotencia, y que favorecen la reprogramación celular. Para esto integramos el estudio, por un lado, de la modulación de vías de señalización asociadas a la diferenciación y pluripotencia, y por otro, de la organización dinámica de los factores de transcripción (FT) fundamentales para las CMP. En una primera parte de este trabajo, intentamos generar CMP bovinas, utilizando dos estrategias complementarias: la derivación de CME y la generación de CMPI. Caracterizamos marcadores moleculares, estudiamos las vías de señalización asociadas a la pluripotencia en embriones bovinos y analizamos diferentes condiciones de reprogramación de células somáticas. Aunque no logramos establecer CMP, identificamos marcadores y vías de señalización relevantes en esta especie. Una etapa fundamental, y que es cuello de botella del proceso de reprogramación, es la reactivación de los FT endógenos de pluripotencia en el genoma de las células terminalmente diferenciadas. Estos FT inducen genes necesarios para preservar el estado indiferenciado y reprimen otros involucrados en la diferenciación. Además de los niveles de expresión de estos FT, su distribución y dinámica de interacción con la cromatina impactan sobre la expresión génica; por lo que, en una segunda parte de esta tesis, nos centramos en el estudio de la organización dinámica de los FT Oct4 y Sox2, en diferentes contextos celulares en un modelo de ratón. Para ello, generamos líneas estables de CME, CMPI y fibroblastos que codifican los FT Oct4 o Sox2 fusionados a una proteína fluorescente. En estas líneas estudiamos la organización dinámica de estos FT en CMP indiferenciadas, al inicio de la diferenciación y en fibroblastos. Analizamos cuantitativamente la distribución subnuclear de Oct4 y Sox2, junto con la de la histona H2B y la proteína asociada a heterocromatina HP1. Asimismo, exploramos la dinámica de interacción de estos FT, mediante espectroscopía de correlación de fluorescencia (FCS). Nuestros resultados muestran que el inicio de la diferenciación dispara cambios en la organización de Oct4 y Sox2 dentro del espacio nuclear y modifica las interacciones entre estos FT y la cromatina en CMP. Esta reorganización podría contribuir a modular su función en etapas tempranas de la diferenciación antes de la disminución de sus niveles. Asimismo, encontramos diferencias entre los diferentes tipos celulares analizados. Finalmente, encontramos que el tratamiento con moléculas pequeñas que son utilizadas para aumentar la eficiencia de reprogramación promueve una reorganización de la cromatina, por lo que nos proponemos analizar la dinámica de Oct4 en presencia de las mismas, a lo largo del proceso de reprogramación. Creemos que las herramientas generadas y los resultados de este trabajo contribuyen al entendimiento de los procesos subyacentes a la pluripotencia y relevantes durante la reprogramación celular.

Identificador:

https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6770_VaquezEchegaray