Obtención y análisis de imágenes de alta resolución de señales intracelulares de calcio

Institución otorgante:

Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Fecha:

2018-03-27

Tipo de documento: 

info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
 

Formato:

application/pdf

Idioma:

spa

Temas:

SEÑALES DE CA2+ INTRACELULARES - RECEPTORES DE IP3 CA2+ LUMINAL - DINAMICA ESPACIO-TEMPORAL - MICROSCOPIA CONFOCAL - MICROSCOPIA WIDE-FIELD - INTRACELLULAR CA2+ SIGNALS - IP3 RECEPTORS - LUMINAL CA2+ - SPATIO-TEMPORAL DYNAMICS - CONFOCAL MICROSCOPY - WIDE-FIELD MICROSCOPY

Descripción:

El ión calcio (Ca2+) es usado por prácticamente todos los tipos celulares para señalizar procesos tan diversos como la fertilización, la comunicación neuronal, la contracción muscular o la muerte celular. La versatilidad de este mensajero se basa en la variedad de patrones espacio-temporales que la concentración intracelular de Ca2+ puede desplegar. Dentro de las células el Ca2+ citosólico libre es mantenido a muy baja concentración. Las señales entonces involucran el ingreso de Ca2+ desde el medio extracelular o su liberación desde reservorios internos. Dentro de este último tipo de procesos, la liberación desde el retículo endoplasmático (RE) a través de receptores (RIP3s) de inositol 1,4,5-trisfosfato (IP3) juega un rol fundamental. En la mayoría de los casos estos receptores están organizados en cúmulos sobre la membrana del RE y pueden abrirse cuando ligan IP3 y Ca2+. El Ca2+ citosólico tiene un rol dual sobre la cinética de los RIP3s llevándolos a su apertura a concentraciones moderadas y a su inhibición a concentraciones altas. Es por esto que el Ca2+ liberado a través de un RIP3 abierto puede inducir la apertura de canales vecinos. Este fenómeno es conocido como liberación de Ca2+ inducida por Ca2+ (CICR, por su nombre en inglés). En la mayoría de las células los cúmulos de RIP3s están separados por unos pocos micrones. La organización interna de los cúmulos, por otro lado, no es totalmente conocida aunque se supone que puede variar entre situaciones con RIP3s muy empaquetados y otras con mayor separación entre canales. Dado que las características de las se~nales resultantes dependen del CICR, la distribución espacial de RIP3s intra e inter-cúmulo juega un rol fundamental. Es por esto que la obtención y el análisis de imágenes con resolución suficiente para poder inferir cómo ocurre el acoplamiento entre receptores mediado por calcio es clave. Dependiendo del número de receptores o cúmulos que participan de un mismo evento de liberación, las señales de Ca2+ mediadas por RIP3s permanecen localizadas o se transforman en ondas que viajan entre cúmulos, abarcando, eventualmente toda la célula. Las señales localizadas (elementales) mediadas por RIP3s son llamadas blips o puffs según haya uno o varios RIP3s de un cúmulo simultáneamente abiertos. A través del CICR, los puffs de Ca2+ constituyen los ladrillos fundamentales de las señales más globales. La variedad de las señales que pueden surgir entonces dependen de la inter-relación entre la cinética y arreglo espacial de los canales, el nivel de Ca2+ citosólico, la tasa de liberación de Ca2+ y de los mecanismos que lo atrapan o remueven. El objetivo de la Tesis es develar algunas de las propiedades de estos mecanismos y estudiar cómo se afectan unos a otros. En esta tesis combinamos experimentos, su análisis y el desarrollo de modelos matemáticos para obtener un descripción detallada de los distintos aspectos que moldean el acoplamiento entre eventos de Ca2+ elementales. Esto es particularmente importante dado que el proceso desde se~nales locales a globales (o spikes) es clave para la determinación de los intervalos de tiempo entre spikes. Se cree que la información está codificada en la frecuencia de estos spikes. Por lo tanto, nuestro objeto de estudio está directamente implicado en la habilidad del Ca2+ de transmitir el mensaje que transporta. Para estudiar se~nales de Ca2+ mediadas por RIP3s experimentalmente, usamos el ovocito de Xenopus laevis como sistema modelo. Este es un modelo conveniente, entre otras cosas, porque el Ca2+ es liberado desde el RE exclusivamente a través de RIP3s. Los experimentos involucraron la observación de se~nales de Ca2+ usando diferentes indicadores de Ca2+ fluorescentes (citosólicos y luminal), buffers exógenos e IP3 enjaulado que fue fotoliberado dentro de las células para inducir la apertura de los RIP3s. Para monitorear cambios en la uorescencia, usamos microscopía confocal multiespectral y microscopía wide-field. Para el modelado usamos descripciones estocásticas y deterministas dependiendo de los aspectos que intentamos describir. En primer lugar investigamos el tamaño de los eventos de Ca2+ observados en ovocitos inmaduros de Xenopus laevis. La distribución de amplitudes de puffs obtenida no fue gaussiana sino que había una notable fracción de eventos de gran tamaño. La distribución de áreas de puffs mostraba una cola larga y podía ser ajustada con una relación tipo ley de potencias. Este comportamiento tipo ley de potencias se encontró también dentro de un modelo simple que incluía acoplamiento entre se~nales individuales para un amplio rango de valores de los parámetros. Un análisis del modelo mostró que una elevación global de la concentración de Ca2+ era muy importante para determinar si la distribución de tama~no de eventos tenía o no cola larga. Esto nos sugirió que la remoción del Ca2+ del citosol es clave para determinar el tipo de se~nales que podían surgir. Determinamos que cuando el Ca2+ no es removido del citosol a una tasa lo suficientemente alta, la transición del RIP3 de un estado inhibido a un estado activo lleva a una liberación inmediata de Ca2+ y a la propagación de una se~nal de baja intensidad. Investigamos luego el rol del Ca2+ luminal en las se~nales. Mientras que el rol del Ca2+ citosólico ha sido ampliamente estudiado, el rol del Ca2+ luminal en las se~nales de Ca2+ mediadas por RIP3 no ha sido investigado con tanto detalle. Desarrollamos un protocolo original para usar el indicador Fluo-5N AM en ovocitos de Xenopus laevis. Este indicador de Ca2+ había sido usado para sensar Ca2+ luminal en otros tipos celulares pero nunca había sido usado en ovocitos. Combinando el uso del Fluo-5N AM y el de un indicador de Ca2+ citosólico cuya emisión ocurre a una longitud de onda diferente (Rhod-2) seguimos la dinámica del Ca2+ luminal y del Ca2+ citosólico en simultáneo durante las señales. A partir del análisis de estas observaciones, cuantificamos las tasas de liberación y de recaptura del Ca2+ al lumen. Determinamos que la liberación de Ca2+ en el citosol a través de RIP3s abiertos no podía explicar por si misma la dinámica observada en el lumen. Concluimos entonces que existe una fuente virtualmente inagotable de Ca2+ libre luminal que atribuimos a los buffers de Ca2+ luminal que muy rapidamente compensan la depleción de Ca2+ local que la liberación puede eventualmente producir. Esto es diferente al comportamiento observado durante la liberación de Ca2+ desde el retículo sarcoplasmático (RS) en miocitos. Atribuimos esta diferencia a la diferencia entre el cociente entre el área y el volumen en ambos tipos celulares. Por lo tanto, concluimos que la geometría no solamente determina la propagación de señales intracelulares de Ca2+ desde el lado citosólico sino también desde su contraparte luminal. Realizamos también experimentos para estudiar y comparar la dinámica espacio-temporal del Ca2+ uminal y citosólico. Para este fin, usamos nuevamente Fluo-5N y Rhod-2 para observar el comportamiento del Ca2+ en ambos reservorios simultáneamente durante una liberación de IP3 prolongada en diferentes regiones. Estos experimentos nos permitieron explorar el acoplamiento entre regiones distantes en cada reservorio. Su análisis sugiere que el Ca2+ citosólico provee el mecanismo de inhibición necesario para terminar las se~nales. De esta forma, el Ca2+ citosólico parece ser el principal mecanismo de acoplamiento entre RIP3s tanto para la propagación inicial de las señales como para el tiempo que tardan los canales en recuperarse y permitir que pueda generarse una nueva onda global. Para estudiar el acoplamiento entre canales entre cúmulos distintos, trabajamos finalmente en un set-up alternativo para observar se~nales de Ca2+ con alta resolución temporal y espacial. A pesar de que el microscopio confocal provee seccionado óptico y alto contraste, el escaneo de la muestra en esta técnica impone una desventaja temporal. Usando un microscopio wide-field, iluminación LED y una cámara EMCCD obtuvimos una resolución axial de aproximadamente 1 micrón. Usamos este set-up para observar se~nales de Ca2+ mediadas por RIP3s y obtuvimos imágenes 2D con resolución temporal similar a la de las imágenes confocales en modo line-scan (unidimensionales). Este set-up abre la posibilidad de aplicar herramientas de análisis de super-resolución a los puffs de Ca2+ en ovocitos. Este método puede ser usado para detectar se~nales de Ca2+ en 2D con alta resolución temporal y por lo tanto para estudiar el acoplamiento entre unidades de liberación dentro del cúmulo o entre cúmulos distantes.

Identificador:

https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6524_Lopez