Análisis molecular de la interacción entre e Mal de Río Cuarto virus (MRCV) y sus hospedantes alternativos : plantas e insectos

Institución otorgante:

Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Fecha:

2017-03-23

Tipo de documento: 

info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
 

Formato:

application/pdf

Idioma:

spa

Temas:

MAL DE RIO CUARTO VIRUS - REOVIRUS - SILENCIAMIENTO - RNAS PEQUEÑOS VIRALES - RNASEQ - FRAMESHIFT - MAL DE RIO CUARTO VIRUS - REOVIRUS - RNA SILENCING - SMALL VIRAL RNAS - RNASEQ - FRAMESHIFT

Descripción:

El virus del Mal de Río Cuarto (MRCV) causa la principal enfermedad del maíz en nuestro país y es transmitido de manera persistente y propagativa por delfácidos. Diversas evidencias indican que los virus de este género se originaron de un virus de insectos ancestral y más recientemente adquirieron la capacidad de infectar plantas. La replicación viral está limitada al floema de gramíneas donde provoca síntomas severos, mientras que ocurre en diversos tejidos y es asintomática en los delfácidos vectores. El genoma del MRCV está formado por diez segmentos de RNA de doble cadena (dsRNA) que codifican para trece proteínas. El actual manejo de la enfermedad se realiza a través del monitoreo y control del principal insecto vector, D. kuscheli. Sin embargo, no se han desarrollado prácticas adecuadas ni existen cultivares resistentes en el caso de un eventual brote. El desarrollo de nuevas tecnologías de bajo impacto ambiental que permitan controlar efectivamente la virosis depende de la generación de conocimiento básico sobre la interacción hospedante-virus, particularmente sobre el ciclo viral y de los mecanismos de defensa de ambos hospedantes. El silenciamiento génico mediado por RNA es un mecanismo de regulación génica específico de secuencia que a su vez funciona como sistema de defensa antiviral. Con el objetivo de caracterizar la respuesta diferencial en plantas e insectos infectados con MRCV, se realizó un ensayo de infección controlada utilizando el insecto vector D. kuscheli y plántulas de trigo como modelo hospedante. Se secuenciaron los RNAs pequeños de ambos hospedantes y se caracterizó el perfil de aquellos derivados del genoma viral (vsiRNAs). Se determinó que, mientras que la respuesta en plantas se caracteriza por la generación de “puntos calientes” muy marcados de vsiRNAs en prácticamente todos los segmentos, en insectos la acumulación resultó más homogéneamente distribuida. Por otro lado, la proporción de vsiRNAs derivados de ambas hebras fue prácticamente la misma en ambos hospedantes, por lo que se presume que la maquinaria de silenciamiento tiene acceso a todo el largo de los segmentos en algún momento del ciclo infectivo. Adicionalmente, en plantas se observó una acumulación preferencial de vsiRNAs en el primer tercio de gran parte de los segmentos genómicos, y una correlación inversa entre la acumulación de vsiRNAs y el largo de los segmentos. En D. kuscheli, se identificaron piRNAs por primera vez en esta especie y se descartó la participación directa de los mismos en el silenciamiento antiviral. Finalmente, el análisis del perfil mutacional del virus dentro de cada hospedante evidenció la presencia de sitios altamente variables que son únicos para cada hospedante y que dan lugar mayoritariamente a mutaciones no sinónimas que probablemente se deban a un proceso adaptativo. Dentro de los mecanismos desencadenados por los virus durante el establecimiento de la infección se encuentra la modulación de la expresión de genes del hospedante. Esto puede conducir a cambios en la expresión de genes potencialmente involucrados en la producción de síntomas y/o que intervienen en mecanismos de defensa como el silenciamiento génico que restringen la replicación viral. Con el objetivo de identificar alteraciones en la acumulación de RNAs mensajeros ante la infección con MRCV, se realizó un RNAseq en plantas de trigo infectadas a dos etapas tempranas: 12 y 21 días post infección. Se realizó la anotación manual del genoma de trigo recientemente liberado (TGACv1) y se determinaron los genes diferencialmente expresados a cada tiempo utilizando dos métodos estadísticos. Estudios de enriquecimiento funcional revelaron que la infección con MRCV induce la sobreexpresión de genes que intervienen en la traducción, la biosíntesis de celulosa y la modificación de ácidos nucleicos. Dentro de las categorías de genes subexpresados se encuentran algunos relacionados con vías hormonales implicadas en el desarrollo y crecimiento de la planta: auxinas, citoquininas y brasinoesteorides. El MRCV y la mayor parte de los fijivirus poseen tres segmentos bicistrónicos S5, S7 y S9, y se desconoce el mecanismo implicado en la traducción de los ORFs ubicados hacia el extremo 3’. El segmento S5 presenta un marco abierto de lectura (ORF5-2) parcialmente superpuesto al primero (P5-1). Estudios de genómica comparativa de secuencias del S5 de varias especies de fijivirus permitieron la identificación de una secuencia “UCU_UUU_CG” altamente conservada que podría funcionar como un sitio de deslizamiento ribosomal en la región superpuesta hacia el extremo 5' del ORF 5-2. En este trabajo de Tesis, se llevaron adelante experimentos de traducción in vitro del segmento S5 utilizando diferentes construcciones mutantes que comprobaron experimentalmente la existencia del frameshift que da lugar a una proteína de fusión P5-1/2. Si bien aún resta ahondar en los mecanismos moleculares que ulteriormente determinan la sintomatología, los resultados contenidos en esta Tesis constituyen un insumo sumamente valioso para continuar avanzando en la comprensión del patosistema y poder eventualmente dar lugar a productos biotecnológicos que formen parte de un diseño racional, integrado y sustentable de estrategias de control de la enfermedad.

Identificador:

https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6226_DeHaro