Interacción entre geometría y dinámica en la modulación de señales intracelulares de calcio

Institución otorgante:

Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Fecha:

2016-03-30

Tipo de documento: 

info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
 

Formato:

application/pdf

Idioma:

spa

Temas:

SEÑALES INTRACELULARES DE CALCIO - RECEPTORES DE IP3 - DINAMICA ESPACIO-TEMPORAL - MICROSCOPIA CONFOCAL - FLUCTUACIONES DE LA FLUORESCENCIA - INTRACELLULAR CALCIUM SIGNALS - IP3 RECEPTORS - SPATIO-TEMPORAL DYNAMICS - CONFOCAL MICROSCOPY - FLUORESCENCE FLUCTUATIONS

Descripción:

Las señales de Ca²⁺ son ubicuas y juegan un rol importante en numerosos procesosfisiológicos como la fertilización o la muerte celular. Su versatilidad se basa en la variedadde comportamientos espacio-temporales que puede mostrar la concentración de calciointracelular y en que distintos comportamientos pueden inducir respuestas diferentes. La liberación de Ca²⁺ desde el retículo endoplasmático (RE) hacia el citosol a travésde receptores de inositol 1,4,5-trifosfato (RIP3s) es una componente clave dentro de losmecanismos de señalización por Ca²⁺. Los RIP3s necesitan unir IP3 y Ca²⁺ para abrirsepor lo que la liberación de Ca²⁺ a través de un único RIP3 puede inducir la apertura deotros canales vecinos, mecanismo que se conoce como liberación de calcio inducida porcalcio o CICR por las siglas en inglés. Los RIP3s aparentemente se organizan en cúmulossobre la membrana del RE (clusters). Si el CICR se encuentra limitado a un cluster, lasseñales pueden permanecer localizadas (puffs). En caso contrario, pueden convertirse enondas que se propagan entre clusters. Los puffs son los ladrillos de construcción de esasseñales más globales que se propagan por toda la célula. Por este motivo, existe un graninterés en la determinación de las propiedades de los puffs, especialmente en vista dela actual controversia sobre la distribución espacial de los RIP3s activables. Las señalesde calcio, por otro lado, pueden remodelarse a través de varios mecanismos, entre ellos,el atrapado del Ca²⁺ por parte de buffers. Éstos no sólo disminuyen la concentraciónde Ca²⁺ libre sino que modifican su distribución espacio-temporal de distintos modosdependiendo de su cinética. Los puffs de Ca²⁺ se han observado en células intactas con técnicas ópticas mostrandoque son intrínsecamente estocásticos. La obtención de una imagen correcta dela dinámica de los eventos entonces implica ser capaz de detectar todo el rango de tama~nos de puffs. Éstos se observan usando indicadores de Ca²⁺ de una longitud de ondavisible y buffers exógenos lentos (por ej; EGTA) para disrumpir el CICR entre clusters. Los indicadores de única longitud de onda aumentan su uorescencia al ligar calcio. De esta manera, generan imágenes que dependen fuertemente de su cinética, transportey propiedades fotofísicas. Por este motivo, es de particular importancia determinar losartefactos que generan las condiciones del experimento. La propia existencia de los puffs depende de que los RIP3s están organizados encúmulos. Una distribución uniforme de receptores debería dar lugar típicamente a señalespropagantes tipo ondas. Los ovocitos de Xenopus laevis son un sistema experimentalventajoso para estudiar estas señales. Durante la fertilización se evoca una onda de Ca²⁺ que se propaga por toda la célula. La fertilización ocurre en el huevo maduro. Se ha observado que, al madurar el ovocito, su RE se configura y la distribución delos RIP3s parece ser más uniforme. Esto tiene un correlato en las características de lasseñales evocadas en los ovocitos maduros. En esta Tesis se combinaron experimentos, un análisis teórico y simulaciones numéricaspara evaluar de qué modo la geometría de la distribución de canales se combina conalguno de los otros aspectos que inuyen sobre la distribución de calcio libre para determinarlas características de las señales. El primer aporte fue introducir un métodoque permite establecer clases equivalentes de experimentos de obtención de imágenesrealizados en condiciones diferentes, donde la clase está determinada por la relaciónseñal-ruido que predice el método. Éste también puede utilizarse para estimar el tamaño de las señales más pequeñas que pueden observarse de manera confiable con cadaarreglo y para generar imágenes de uorescencia numéricamente con ruido realista. Esta Tesis también contribuyó a estudiar si la presencia del indicador o del EGTA en distintascondiciones experimentales altera la dinámica intracelular de Ca²⁺, en particular,analizar si son capaces de detectar puffs de Ca²⁺ con similar precisión y de qué modo lasdistintas configuraciones experimentales afectan las propiedades de los puffs observadosy la dinámica del Ca²⁺ subyacente. Se pudo determinar que aunque el indicador o el EGTA no alteran la dinámica intracluster del Ca²⁺, el conjunto de eventos observablesdel experimento es diferente dependiendo del grado de acoplamiento entre clusters. Elestudio, por otro lado, permitió inferir que los puffs con mayor liberación de Ca²⁺ provienende cúmulos donde los RIP3s están muy cerca unos de otros. Para estudiar enmás detalle la disrupción del CICR entre clusters vecinos que inducen los buffers lentos,se realizaron experimentos utilizando simultáneamente dos indicadores de calcio de distintacinética. Utilizando el método introducido pudimos confirmar nuestra conclusiónprevia sobre cómo se modifica el conjunto de eventos que se evoca en presencia de bufferslentos. Por otro lado, determinamos que la presencia de buffers rápidos da lugar a liberacionesde Ca²⁺ más prolongadas tal vez debido a que reducen el efecto inhibidor del Ca²⁺ sobre los RIP3s. En relación a la razón por la que los buffers lentos disrumpen elacoplamiento entre clusters pudimos concluir que su presencia disminuye el Ca²⁺ basal,aunque no tanto como para explicar la disrupción. El análisis de la diferente distribuciónespacio-temporal de los buffers lentos y rápidos parecería indicar la presencia de RIP3sen el espacio entre clusters que podrían ser "silenciados" por los buffers lentos evitandoasí la propagación de las señales entre cúmulos. Finalmente, en la Tesis se han mostradotambién resultados preliminares de señales de calcio que se observan en células maduradas,cuyos cambios pueden explicarse en términos de una distribución espacial distintade RIP3s.

Identificador:

https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5977_Piegari