Caracterización genómica y funcional de los genes AtNIP4;1 y AtNIP4;2 que codifican para proteínas de tipo acuaporinas en Arabidopsis thaliana

Institución otorgante:

Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Fecha:

2015-03-25

Tipo de documento: 

info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
 

Formato:

application/pdf

Idioma:

spa

Temas:

ACUAPORINAS DE POLEN - TRANSPORTE DE AGUA - REPRODUCCION - AQUAPORINS - POLLEN - WATER TRANSPORT - REPRODUCTION

Descripción:

En las Angiospermas, la reproducción incluye procesos en los cuales el transporte de agua estáespacial y temporalmente regulado. Durante la microgametogénesis del polen, el contenido deagua del grano de polen comienza a aumentar de manera significativa desde el estadio tempranode la microespora y continúa haciéndolo hasta la deshidratación parcial. El volumen de polen, aligual que el contenido de agua, disminuye durante la deshidratación de las anteras y el polen, seadapta a las condiciones ambientales durante la dispersión y aumenta durante la rehidratación enel estigma. En plantas con estigmas secos, la regulación de la rehidratación del polenproporciona una barrera temprana y eficaz para las polinizaciones incompatibles. El agua, losnutrientes y otras moléculas pequeñas son transportados rápidamente desde las papilasestigmáticas al grano de polen para promover su germinación por mecanismos que aún no seconocen completamente. Luego durante la elongación del tubo polínico, la entrada adicional deagua a través de la membrana plasmática permite el ajuste citosólico de iones (Ca2+, K+, H+ y Cl–) y de la presión de turgencia. Se ha propuesto que las acuaporinas estarían involucradas enel transporte de agua y/o solutos durante la germinación del polen y el crecimiento del tubopolínico. En Arabidopsis thaliana sólo 4 genes (de un total de 35 loci) se expresan específicamente en losgranos de polen maduros y/o tubos polínicos: AtTIP5;1, AtTIP1;3, AtNIP4;1 y AtNIP4;2. Eneste trabajo de tesis se demuestra la participación de AtNIP4;1 y AtNIP4;2 en los procesosasociados a la reproducción. Los genes AtNIP4;1 y AtNIP4;2 presentan alta identidad desecuencia nucleotídica, estructura génica similar (5 exones, 4 intrones) y están dispuestos entándem. A nivel de proteínas, tienen un 84% de identidad aminoacídica, y comparten losmismos dos motivos NPA y el filtro de constricción ar/R (W, V, A, R), involucrados en laselectividad del transporte. Sin embargo, AtNIP4;1 y AtNIP4;2 muestran diferentes patrones deexpresión. Ensayos de PCR en tiempo real demostraron que AtNIP4;1 tiene niveles relativos deexpresión bajos en polen maduro y que AtNIP4;2 presenta un pico de expresión durante laelongación del tubo polínico. Además, flores transgénicas promotorNIP4;1::GUS mostraronuna fuerte actividad de GUS en los granos de polen maduros y persistente en los tubospolínicos, mientras que las flores promotorNIP4;2::GUS mostraron una fuerte actividad de GUS solamente en el tubo polínico. Por lo tanto, nuestra hipótesis es que AtNIP4;1 y AtNIP4;2podrían tener redundancia funcional durante la reproducción, pero desempeñar roles diferentesy específicos en el desarrollo del polen, la polinización y/o fertilización. Con el objetivo de llevar a cabo experimentos fisiológicos in vitro e in planta, se obtuvieronplantas mutantes simples de inserción de ADN-T y se generaron líneas amiARN dobleknockdown. Las plantas simple mutante y doble knockdown mostraron parámetros de fertilidadafectados: reducción del número de semillas por silicua y segregación distorsionada asociadasolamente al gametofito masculino. Además, las plantas doble knockdown mostraron reducciónde la viabilidad y del diámetro de los granos de polen maduros, aumento del número de granosde polen inmaduros (granos de polen uni y bi-celulares), defectos en la rehidratación de polen,reducción de la tasa de germinación y de la longitud del tubo polínico (especialmente encondiciones limitantes de ácido bórico), y aumento del porcentaje de las flores no polinizadas. También se generaron líneas de complementación que expresan las proteínas de fusión eGFPAtNIP4; 1 y eGFP-AtNIP4;2 bajo sus promotores endógenos en el background de susrespectivas líneas simple mutantes. Los análisis de segregación demostraron que estas líneas decomplementación rescatan el fenotipo mutante. Además, mediante microscopía confocal seobservó que la proteínas de fusión eGFP-AtNIP4;1 y eGFP-AtNIP4;2 están localizadas en lamembrana plasmática y en vesículas intracelulares de los granos (AtNIP4;1) y tubos polínicos (AtNIP4;1 y AtNIP4;2). Ensayos de expresión heteróloga de eGFP-AtNIP4;1 y eGFP-AtNIP4;2en ovocitos de Xenopus laevis confirmaron que ambas acuaporinas presentan una bajapermeabilidad al agua y un significativo transporte de glicerol. Ensayos de actividad quinasa invitro demostraron que los dominios C-terminales de AtNIP4;1 y AtNIP4;2 son fosforiladosespecíficamente en Ser267 por AtCPK34, una proteína quinasa dependiente de calcio expresadaen polen, sugiriendo que la fosforilación puede regular su actividad de transporte in planta. Enresumen las evidencias obtenidas en esta tesis doctoral permiten sugerir que AtNIP4;1 estaríainvolucrada principalmente en las etapas del desarrollo del polen, polinización y germinación, y AtNIP4;2 tendría un rol preponderante en la elongación del tubo polínico. Palabras claves: acuaporinas de polen, transporte de agua, reproducción

Identificador:

https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5722_Perez