Mecanismo de reconocimiento de un epítope intrínsecamente desordenado por un anticuerpo monoclonal : integración mecanística y estructural

Institución otorgante:

Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Fecha:

2014-11-27

Tipo de documento: 

info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
 

Formato:

application/pdf

Idioma:

spa

Temas:

ONCOPROTEINA E7 - ANTIGENO - ANTICUERPO - SELECCION CONFORMACIONAL - ISOMERIZACION DE PROLINAS - PROTEINAS INTRINSECAMENTE DESORDENADAS - E7 ONCOPROTEIN - ANTIGEN - ANTIBODY - CONFORMATIONAL SELECTION - PROLYL ISOMERIZATION - INTRINSICALLY DISORDERED PROTEINS

Descripción:

El reconocimiento de antígenos por medio de anticuerpos es un eventofundamental en la respuesta inmune adaptativa. A su vez la formación de los complejos Antígeno:Anticuerpo es extensivamente utilizada como modelo de estudio de interacciónproteína-proteína. En la presente tesis estudiamos el mecanismo de reconocimiento de unanticuerpo monoclonal específico, M1, por la proteína E7 del papilomavirus humano (HPV). E7 es la oncoproteína que constituye la principal actividad transformante del virus y además esparadigma de proteínas intrínsecamente desordenadas (IDP). E7 se expresa constitutivamente entejidos de carcinoma y la aparición de anticuerpos específicos ocurre con alta frecuencia enpacientes con cáncer cervical. Llevando a cabo un mapeo epitópico determinamos que elanticuerpo M1 reconoce específicamente una región inmunodominante de la proteína de HPV- 16 denominada “bisagra”, por conectar el dominio IDP N-terminal con el dominio globular Cterminalde la misma. Experimentos cinéticos mostraron que la región reconocida por M1, lacual posee dos residuos de prolina, comprende al menos dos poblaciones separadas por una altabarrera energética (~ 22 Kcal/mol). Los estudios de Resonancia Magnética Nuclear identificaronel origen de esta barrera como un evento de isomerización cis-trans de las prolinas presentes enel epítope de reconocimiento. Se determinó que el anticuerpo M1 reconoce específicamente alepítope en su conformación minoritaria (10%), que posee sus prolinas en cis, mediante elmecanismo de selección conformacional. Por lo tanto, se requiere que el 90% de las moléculasque se encuentran en configuración trans isomericen previo a la unión con el anticuerpo. Lavelocidad de asociación del conformero cis por M1 ( kon = 6 x 107 M-1 s-1) se encuentra entre lasmás rápidas para las interacciones Antígeno:Anticuerpo, a pesar de que la reacción global esextremadamente lenta (t1/2 ~ 4 min). Esto indica que la reacción de asociación se encuentralimitada por un evento de isomerización de prolina. Utilizando mutantes puntualesdemostramos que la P41 en su conformación cis es la requerida para la unión con el anticuerpo. Luego del evento lento de pre-equilibrio y de la unión con M1, ocurre un evento de rearreglounimolecular, formándose finalmente un complejo consolidado de alta afinidad (KD 120 nM). Nuestros resultados sugieren que la presentación de este epítope viral por las célulaspresentadoras de antígeno tiene que haber estado en su configuración minoritaria cis, al generarel clon que produce el anticuerpo específico. Finalmente, mostramos la importancia de losdeterminantes estructurales presentes en regiones desordenadas en el reconocimiento entremacromoléculas. Dado que numerosas proteínas virales son multifuncionales debido a sunaturaleza IDP, los resultados presentados en esta tesis sientan la bases para el análisis delmecanismo de reconocimiento por medio de anticuerpos de epítopes virales intrínsecamentedesordenados.

Identificador:

https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5629_Fassolari