Estudio de mutaciones noveles como causa de la deficiencia de 21-hidroxilasa

Institución otorgante:

Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Fecha:

2014-09-16

Tipo de documento: 

info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
 

Formato:

application/pdf

Idioma:

spa

Temas:

DEFICIENCIA 21-HIDROXILASA - GEN CYP21A2 - MUTACIONES NOVELES - ESTUDIO FUNCIONAL - 21-HYDROXYLASE DEFICIENCY - CYP21A2 GENE - NOVEL MUTATIONS - FUNCTIONAL STUDIES

Descripción:

Con el nombre de Hiperplasia Suprarrenal Congénita (HSC) se conoce a un conjunto deenfermedades autosómicas recesivas en las que se encuentra afectada la esteroidogénesisadrenal. En el 95% de los casos, la HSC se produce por deficiencia de la enzima 21-hidroxilasa. Esta deficiencia puede manifestarse en forma severa o clásica (FC), o leve o noclásica (FNC). La enzima está codificada por el gen CYP21A2, que se encuentra duplicado yrepetido en tándem junto a un pseudogen CYP21A1P con el que comparte 98% de identidadde secuencia. La elevada identidad de secuencia produce que la región sea propensa alalineamiento incorrecto y a la recombinación desigual, como así también a la transferencia desecuencias del pseudogen al gen mediante el mecanismo de conversión génica. La mayorparte de los afectados son compuesto heterocigotas ya que poseen diferentes mutaciones encada uno de sus alelos. En estos casos, la manifestación clínica de la enfermedad será aquellaque se relaciona con el alelo con mayor actividad enzimática. Si bien la mayor parte de lospacientes presentan mutaciones derivadas del pseudogen, hasta la fecha se identificaron másde 240 mutaciones diferentes como causales de la patología. En un trabajo previo de nuestro laboratorio se analizó la presencia de las 10 mutaciones másfrecuentes derivadas del pseudogén en pacientes con deficiencia de 21-hidoxilasa de nuestrapoblación. En esta tesis se estudió por secuenciación todo el gen CYP21A2 y su regiónpromotora en muestras de ADN de 87 pacientes (15 FC y 72 FNC) en los cuales restabadeterminar el defecto causante de la patología en uno o en ambos alelos del gen. Nuestro análisis reveló la presencia de 12 mutaciones poco frecuentes ya descriptaspreviamente y 7 mutaciones noveles, 6 en la región codificante y 1 en un sitio aceptor desplicing en el intrón 5. Para todas las mutaciones noveles halladas se analizaron 50 individuosde la población general mediante amplificación de la región de interés y cortes con enzimasde restricción y en ningún caso se halló la presencia de las mismas. Se hallaron asimismo,variantes de secuencias no descriptas previamente en regiones promotoras e intrónicas que seclasificaron como polimorfismos ya sea porque las mismas se observaron también enindividuos de la población general, o bien porque no se encuentran en sitios que a prioripudieran afectar el splicing, respectivamente.A los efectos de analizar la implicancia biológica de las mutaciones noveles halladas, serealizaron aproximaciones bioinformáticas y ensayos funcionales. Dado que la proteína CYP21A2 humana no está cristalizada, la misma se modeló mediante herramientas in silico apartir de 18 cristalografías de otras proteínas de la familia CYP. Una vez obtenido el modelo,se analizó la estabilidad de las mutantes aminoacídicas halladas que no generabancorrimiento del marco de lectura. Las predicciones indicaron cambios en la estabilidad y/ocarga de la superficie de la proteína que sugerirían un posible efecto deletéreo de las mismas. Para los ensayos funcionales, se realizaron mutagénesis dirigidas sobre un vector quecontiene al ADNc de CYP21A2, transfección en células COS-7 y estimación de la expresiónde la proteína y de su actividad mediante Western Blot y cromatografía en placa delgada (TLC), respectivamente. En todos los casos, las mutantes presentaron una actividadenzimática residual (AER) entre el 15 y el 50%, que se corresponderían con alelosrelacionados a la FNC de la patología. En uno de los pacientes, una de las mutaciones novelesse encontraba en el mismo alelo con otra descripta previamente. Los ensayos funcionalesdemostraron que si bien las mismas en forma aislada son leves, la presencia de ambas en cispredice un alelo severo con una AER cercana al 2%. Para algunas de las mutacionespuntuales y para la doble mutante se observó una disminución en la cantidad de proteínaresultante. Para la mutación en el sitio aceptor de splicing en el intrón 5, los análisis bioinformáticospredijeron la anulación del sitio canónico y la presencia de 2 sitios crípticos de splicing, unoen la mitad del intrón 5 y otro en el exón 6. Para evaluar la eficiencia de splicing in vitro, losestudios funcionales consistieron en la construcción de un minigén mediante amplificación deun fragmento entre el exón 4 y el exón 7 del gen, posterior clonado en un vector de expresión,transfección en células HeLa, HEK-293 e Y-1 y valoración del ARNm obtenido por RTPCR. Los ensayos revelaron que la mutante presentaba un ARNm más corto que la salvajeproducto de una deleción de 16 nucleótidos debido a la utilización del sitio críptico desplicing dentro del exón 6. Esta deleción generaría un codón de terminación prematuro quepredice un alelo severo relacionado con la FC de la patología. Mediante este estudio, el genotipo se completó en 27 de los 87 pacientes (100% de lospacientes FC y 16,6% FNC). Estos resultados señalarían que es probable que el valor de 17-hidroxiprogesterona (17-OHP) post estímulo con ACTH (test que se realiza para incluir a lospacientes de la FNC), esté sobreestimando la prevalencia de la patología. A los efectos de disciminar si los valores hormonales difieren entre los pacientes FNC totalmentegenotipificados y aquellos que no, se compararon los valores hormonales de 17-OHP basal ypost estimulación con ACTH, así como los de Dehidroepiandrosterona-sulfato (DHEA-S), Testosterona (T) y Androstenediona (A) de 271 pacientes diagnosticados como FNC. Losmismos fueron agrupados de acuerdo a si poseen los 2 alelos mutados, uno o ninguno. Losresultados obtenidos indican que no hay diferencias significativas entre los grupos estudiadoscuando se analizaron los valores de A, T y DHEA-S. Sin embargo, en el caso de 17-OHPbasal y post ACTH, se observan diferencias significativas entre aquellos que poseen ambosalelos con mutación y los demás grupos de estudio. Asimismo, se observó que si lospacientes presentaban valores de 17-OHP post ACTH entre 10 (valor hormonal de corte parala inclusión de pacientes) y 20 ng/ml, sólo en el 23% se hallaban los 2 alelos mutados Si elvalor hormonal era mayor a 20 ng/ml, el 85% posee ambos alelos con mutación. Por último, analizando los genotipos encontrados en todos los pacientes de nuestra cohorte,ya sea mediante secuenciación o mediante el estudio de las 10 mutaciónes más frecuentes,observamos que en un 97,7% de los pacientes el fenotipo se correspondía con el genotipohallado. Las principales discordancias se hallaron en pacientes con la mutación p.I172N, yaque la misma se asoció tanto a la forma virilizante simple (VS) como a la forma perdedora desal. Por otro lado, si bien la mutación p.R356W está altamente relacionada a la forma PS dela enfermedad, un paciente VS presentaba esta mutación en heterocigosis compuesta con otramutación que predice una enzima sin actividad en el alelo homólogo. Asimismo, en laliteratura se describe a la mutación poco frecuente p.H62L como una mutación leve yasociada a la FNC de la patología. En esta tesis, sin embargo, se refiere que la misma serelacionaría también con la forma VS de la enfermedad. Por último, la mutación pocofrecuente p.R341P se asocia a la forma VS, si bien en este trabajo se describe un paciente PSque poseía esta mutación en heterocigosis compuesta con la mutación c.283-13A/C>G en elotro alelo.

Identificador:

https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5617_Taboas