Interacción de la proteína quinasa dependiente de cAMP con sus genes blanco en Saccharomyces cerevisiae

Institución otorgante:

Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Fecha:

2014-03-20

Tipo de documento: 

info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
 

Formato:

application/pdf

Idioma:

spa

Descripción:

La regulación de la expresión génica mediada por proteínas quinasas es esencial para lacorrecta adaptación celular frente a un estímulo extracelular. En S. cerevisiae, la PKA estáformada por tres subunidades catalíticas: Tpk1, Tpk2 y Tpk3 y una subunidad regulatoria: Bcy1. Existen antecedentes que indican la asociación de Tpk1 y Tpk2 a la cromatinadurante el crecimiento en glucosa, glicerol y estrés oxidativo (Pokholok et al, 2006). El rolde la vía cAMP/PKA sobre la expresión génica en glucosa ha sido ampliamente estudiado (Livas et al, 2011). Por otro lado, se ha descripto, que la activación de la PKA limita laexpresión de genes de respuesta a estrés (Leadsham et al, 2010; Ferretti et al, 2012). Durante el desarrollo de esta tesis analizamos la unión de Bcy1, Tpk1 y Tpk2 a diferentesregiones génicas en respuesta a estrés osmótico y oxidativo. Describimos que tanto lassubunidades catalíticas como la subunidad regulatoria de la PKA se encuentranasociadas tanto a regiones transcriptas como a promotores de los genes blancos demanera estrés-dependiente. Además analizamos el requerimiento de la actividad quinasay el papel de Bcy1 en la asociación de las Tpks a la cromatina. Versiones inactivas de Tpk1 y Tpk2 no se asociaron a la cromatina. La deleción de Bcy1 promueve una mayorasociación de Tpk1, mientras que anuló la asociación de Tpk2. Luego analizamos elposible rol de las Tpk en el remodelado de la cromatina en respuesta a estrés a través delanálisis de la cinética de unión de factores remodeladores de la cromatina a las regionesdonde encontramos asociadas a Tpk1 y Tpk2. Observamos unión transitoria a lacromatina de Arp8, Rsc1 y Snf2 seguido temporalmente por la asociación de las Tpk. Observamos también, la ocupación concomitante de Tpk2 y el factor de transcripción deunión al DNA Rap1. En conjunto los datos existentes y los resultados obtenidos en esta tesis sugieren que la PKA podría participar en la expresión génica mediante fosforilación in situ de losreguladores transcripcionales o de la cromatina. La distribución núcleo-citoplasmática permite regular la actividad diferencial de muchasproteínas quinasas. Hemos analizado la localización subcelular de las subunidades de PKA y su mecanismo de transporte durante estrés. Hemos observado que Tpk1-GFP y Tpk3-GFP acumulan en el núcleo post-estrés oxidativo y osmótico, sin embargo Tpk2- GFP y Bcy1-GFP no cambian su acumulación nuclear. El análisis cinético de laacumulación nuclear de Tpk1 mostró mayor velocidad en respuesta a estrés osmóticoversus oxidativo. Hemos determinado que la acumulación nuclear de Tpk1, Tpk2, Tpk3 y Bcy1 es unmecanismo de transporte activo. Sorprendentemente, cada una de las subunidades de PKA es importada al núcleo por diferentes carioferinas. Por otra parte, las cepasdefectivas en carioferinas las cuales impiden la acumulación nuclear específicamente de Tpk1 o Tpk2 no mostraron asociación a la cromatina las Tpks, lo que sugiere elrequerimiento de acumulación nuclear de las subunidades catalíticas para la asociación asus genes blancos.

Identificador:

https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5535_Baccarini