Caracterización bioquímica y estructural de glicosiltransferasas bacterianas

Institución otorgante:

Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Fecha:

2013-06-19

Tipo de documento: 

info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
 

Formato:

application/pdf

Idioma:

spa

Temas:

GLICOSILTRANSFERASAS - XANTANO - GUMK - GUM I - XANTHOMONAS CAMPESTRIS - CAMBIOS CONFORMACIONALES - PROTEINAS DE MEMBRANA - GLYCOSYLTRANSFERASAS - XANTHAN - GUM K - GUM I - XANTHOMONAS CAMPESTRIS - CONFORMATIONAL CHANGES - MEMBRANE PROTEINS

Descripción:

Los polisacáridos juegan un papel esencial en el metabolismo celular y en el funcionamiento delos organismos. Son sintetizados empleando enzimas glicosiltransferasas (GTs), cuyaspropiedades determinan el tamaño y la estructura del producto final. Muchas GTs estánlocalizadas en membranas celulares, dificultando su purificación y caracterización. En estetrabajo de Tesis se estudian bioquímica y biofísicamente dos GTs que participan en la síntesisdel polisacárido xantano producido por Xanthomonas campestris. La primer GT es GumI, de la cual sólo había escasos antecedentes genéticos. En esta Tesis sepresenta la primera caracterización bioquímica y funcional de GumI, demostrando su actividadglicosiltransferasa previamente propuesta. Se realizaron ensayos de complementación funcional,demostrando su actividad manosiltransferasa in vivo. Además, se demostró que GumI está unidaa la membrana, y que la interacción está mediada por interacciones hidrofóbicas yelectrostáticas. GumI fue purificada y su actividad fue estudiada in vitro, obteniéndose losparámetros óptimos de reacción. GumI dio origen a una nueva familia, GT-94, en laclasificación Carbohydrate Active EnZymes. Finalmente, mediante ensayos de cristalización seobtuvieron agujas bidimensionales que al presente no fueron aptas para resolver la estructura de GumI por cristalografía de rayos-X. La segunda GT es GumK, cuya estructura cristalina se resolvió en el laboratorio y, como GumI,es una GT monotópica de membrana. Se profundizó sobre las bases moleculares de la unión asus sustratos y a la membrana. Se realizaron diferentes mutaciones sobre la zona propuesta deunión a la membrana, demostrando la complejidad de dicha interacción. Además, se realizaronestudios por simulación computacional con el fin de obtener la estructura del complejo GumK/UDP-GlcA. El modelo obtenido explicaría la especificidad por este sustrato. Estudiosrealizados en este trabajo mediante diversas técnicas -tales como proteólisis limitada,fluorescencia, dicroísmo circular, calorimetría isotérmica de titulación, resonancia magnéticanuclear y dispersión de rayos-X a bajo ángulo- sugieren fuertemente la presencia de cambiosconformacionales disparados por la unión de UDP-GlcA.

Identificador:

https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5385_Salinas