Estudio de la regulación de la expresión y de la relevancia de la metiltransferasa PRMT8 en células madre pluripotentes

Institución otorgante:

Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Fecha:

2013-03-26

Tipo de documento: 

info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
 

Formato:

application/pdf

Idioma:

spa

Temas:

CELULAS MADRE EMBRIONARIAS - CELULAS MADRE PLURIPOTENTES INDUCIDAS - AUTO-RENOVACION - PLURIPOTENCIA - ARGININA METILTRANSFERASAS - EPIGENETICA - EMBRYONIC STEM CELLS - INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS - SELF-RENEWAL - PLURIPOTENCY - ARGININE METHYLTRANSFERASES - EPIGENETICS

Descripción:

Las células madre embrionarias (ESCs) son células derivadas del macizo celularinterno (ICM) del blastocisto. Poseen la capacidad de auto-renovarse indefinidamenteen cultivo y de dar origen a células de las tres capas germinales, propiedad conocidacomo pluripotencia. Existen tres factores de transcripción fundamentales para laregulación génica de las células madre pluripotentes, Oct4, SOX2 y Nanog. Estudios deinmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) han revelado que estos factores ocupan almismo tiempo las regiones promotoras de diversos genes a lo largo de todo elgenoma, sugiriendo que estos factores actúan como el núcleo de una red regulatoriaque modula la expresión de genes involucrados en la diferenciación celular. Mientrasque in vitro las ESCs pueden ser mantenidas indefinidamente en estado indiferenciado,in vivo, conforme progresa el desarrollo, las células del ICM abandonan su estadopluripotente para seguir diversos programas de diferenciación. El inicio de dichosprogramas depende, en gran medida, de la regulación de la expresión de genes tejidoespecíficos. Sin embargo, entender cuáles son estos genes y cómo son regulados no essuficiente para explicar el comienzo del proceso de diferenciación celular. Existenademás, cambios en la organización de la cromatina a nivel global y de loci específicos,registrándose múltiples evidencias que relacionan la estructura de la cromatina de losgenes marcadores de estadio indiferenciado con el mantenimiento de la pluripotencia. Nuestra hipótesis postula que existiría una relación bidireccional entre losniveles y la actividad de proteínas que remodelan la cromatina y de los factores detranscripción críticos en el mantenimiento de las propiedades de las célulaspluripotentes. El objetivo general de este trabajo es contribuir al esclarecimiento de laregulación epigenética que ocurre en las ESCs durante la diferenciación y el estadoepigenético de éstas cuando son mantenidas en estado indiferenciado. Para ello, nospropusimos, en primer lugar analizar el patrón de expresión de proteínas modificadoras de la cromatina en ESCs indiferenciadas y en distintos estadios dediferenciación. Luego, una vez detectados genes de interés,evaluar el efecto de lamodificación de sus niveles de expresión sobre el mantenimiento del estadoindiferenciado y en la diferenciación de las ESCs. Por último, nos propusimos estudiarsi los factores de transcripción relevantes en la preservación de la pluripotenciaregulan la expresión los genes en estudio. Para nuestro primer objetivo, analizamos la expresión de enzimas relacionadascon el remodelado de la cromatina mediante RT-qPCR en ESCs indiferenciadas y lascomparamos con la de células terminalmente diferenciadas. Posteriormente,diferenciamos ESCs mediante un protocolo no dirigido y analizamos la expresión deestos genes lo largo del proceso de diferenciación. Esta búsqueda arrojó una serie degenes candidato que podrían tener un rol en el mantenimiento de las propiedadesbásicas de las ESCs. Posteriormente, elegimos uno de estos genes, la metiltransferasa Prmt8, para continuar nuestros estudios. Los otros genes que surgieron de este análisisforman parte de otros proyectos de tesis. Utilizando tanto un protocolo dediferenciación no dirigido como uno dirigido hacia linaje neural, comprobamos que elgen de Prmt8 se regula negativamente durante el proceso de diferenciación. Por otraparte, construimos una línea estable de mESCs que contiene en su genoma un shRNAinducible contra Prmt8. Probamos que al inducir este shRNA los niveles de mensajerode esta enzima disminuyen, y que esto en un principio no afecta la capacidad de autorenovaciónde las células. Mediante análisis de inmunofluorescencia estudiamos lapresencia y localización de marcadores del estado indiferenciado. No encontramosdiferencias sustanciales en los marcadores analizados al comparar las célulascultivadas en presencia del inductor del shRNA con las células control. Por otro lado,diferenciamos la línea que sub-expresa Prmt8 y encontramos que estas célulasparecen diferenciarse de forma diferente al control. Por último, analizamos si laexpresión forzada de los factores de transcripción de pluripotencia modula laexpresión de Prmt8 en un sistema heterólogo. En conjunto los datos sugieren que Prmt8 es regulado positivamente por losfactores de transcripción de pluripotencia, y modulado durante la diferenciación,hecho que podría ser clave en la determinación del tipo celular de destino. En el futuroplaneamos realizar estudios de inmunoprecipitación de la cromatina para estudiar la interacción de estos factores con el promotor de Prmt8. Por otra parte, nos interesaestudiar con mayor profundidad si la presencia de esta metiltransferasa es vital para ladiferenciación hacia algún tipo celular en particular. Creemos que los conocimientos generados en el campo de la epigenética decélulas madre pueden contribuir a plantear estrategias que ayuden, en un futuro, adiseñar nuevas terapias celulares.

Identificador:

https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5297_Luzzani