Caracterización cuantitativa de señales intracelulares de calcio

Institución otorgante:

Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Fecha:

2011

Tipo de documento: 

info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
 

Formato:

application/pdf

Idioma:

spa

Temas:

DINAMICA DE CALCIO - RECEPTORES DE IP3 - PROCESOS DE DIFUSION Y REACCION - ESPECTROSCOPIA DE CORRELACION DE LA FLUORESCENCIA - MICROSCOPIA CONFOCAL - CALCIUM DYNAMICS - IP3 RECEPTORS - DIFFUSION AND REACTION PROCESSES - FLUORESCENCE CORRELATION SPECTROSCOPY - CONFOCAL MICROSCOPY

Descripción:

Las señales de calcio son utilizadas por una enorme variedad de células para regular procesos tan distintos como la fertilización o la muerte celular, entre muchos otros. La versatilidad del ión calcio como agente señalizador se basa en la gran diversidad de comportamientos que su concentración puede desplegar dentro de las células. Desentrañar la compleja trama de mecanismos que determinan dichos comportamientos es un enorme desafío que requiere la combinación de estrategias múltiples tanto experimentales como de modelado. En particular, el amplio rango de escalas espaciales y temporales involucradas no puede ser abarcado con un unico tipo de experimentos y es entonces que la elaboración de modelos que permitan conectar observaciones dispares se vuelve indispensable. Por otro lado, para que los modelos puedan cumplir este rol es necesario contar con estimaciones confiables, idealmente obtenidas in situ, de algunas de las cantidades que caracterizan a los fenómenos físicos y químicos involucrados en las señales. El objetivo de esta Tesis ha sido avanzar en la obtención de estas estimaciones realistas realizando experimentos opticos y desarrollando el marco teórico necesario para extraer información cuantitativa de los mismos. Una de las propiedades pobremente caracterizadas es la tasa a la que el calcio se transporta dentro de las células. Existen distintas técnicas opticas para estimar coeficientes de difusión, entre las que se encuentran la espectroscopía de correlación de fluorescencia (FCS) o la recuperación de fluorescencia tras fotoblanqueo (FRAP). La aplicación de las mismas al caso del calcio no es totalmente directa, ya que este ión no sólo difunde al entrar al citosol a través de canales específicos, sino que también reacciona con distintas sustancias (“buffers”) que poseen las células. Para describir este tipo de transporte es posible definir coeficientes efectivos, que contienen información sobre la difusión y las reacciones. Estudios preliminares habrán mostrado la existencia de más de un coeficiente de este tipo. Una de las contribuciones de esta Tesis ha sido estudiar de forma detallada la información que es posible extraer a partir de experimentos de FCS en donde la sustancia observada difunde y reacciona. En particular, se demostró que las técnicas de FCS y FRAP brindan información sobre coeficientes distintos, que puede ser combinada para inferir tasas de reacción yo de difusión libre. Se realizó este estudio teórico para el caso en que la sustancia de interés está marcada fluorescentemente y cuando existen moléculas marcadas y no marcadas en el mismo sistema. Parte de los resultados fueron aplicados para explicar las diferencias observadas en experimentos de FCS y FRAP, realizados para deter minar el coeficiente de difusión del producto del gen bicoid en embriones de moscas Drosophila melanogaster, una sustancia fundamental para el establecimiento del eje dorsoventral en este organismo. La aplicación de técnicas opticas para estudiar el transporte de calcio en células presenta dificultades adicionales. En primer lugar, la observación de la distribución del calcio se hace de modo indirecto, mediante fluoróforos que reaccionan con este ión y cambian sus propiedades espectrales como por ejemplo, aumentar notablemen te la fluorescencia al ligar calcio. Es decir, la sustancia observable (indicador ligado a calcio) está permanentemente transformándose en otra. Por otro lado, para poder inferir a partir de ella la distribución de calcio libre es necesario conocer propiedades del indicador que típicamente no son provistas por quienes lo comercializan, como por ejemplo, los coeficientes de difusión. Otra de las contribuciones de esta Tesis ha sido establecer las bases para la determinación de los coeficientes de difusión y tasas de reacción del calcio y sus fluoróforos, en células. Para tal fin se hicieron, en primer lugar, experimentos de FCS en distintos tipos de soluciones conteniendo calcio e indicador. Se trabajó simultáneamente en los desarrollos teóricos necesarios para el análisis de los mismos. De su aplicación se pudieron determinar coeficientes de difusión y parámetros de reacción en solución. Entre los experimentos se realizó un subconjunto conteniendo calcio, indicador y un “buffer” adicional. A partir del estudio detallado de estos ultimos se elaboró una propuesta de cómo obtener estos coeficientes en células intactas donde las propiedades de los “buffers” presentes son desconocidas. La versatilidad de las señales intracelulares de calcio depende, entre otras cosas, de la distribución espacial y de la cinética de los canales a través de los cuales los iones ingresan al citosol. Entre estos, los receptores de inositol (1,4,5)-trifosfato (IP3 R) constituyen una de las vías más importantes para este ingreso. Estos canales se encuentran en la membrana del retículo endoplasmático organizados en cúmulos que se supone son de unos 100 nm de lado y que están, a su vez, separados por algunos milímetros entre sí. Los canales se abren cuando ligan calcio e IP3 R el que, en condiciones fisiológicas, es sintetizado a partir de elementos presentes en la membrana plasmática cuando la célula recibe una señal. La distribución inhomogénea de los canales junto con el efecto del calcio liberado sobre la probabilidad de aper- tura se combinan para dar lugar a una jerarquía de señales que van desde las muy localizadas hasta las ondas que viajan por toda la célula. Contar con información cuantitativa sobre la geometría de los cúmulos y sobre la cinética de los canales in situ es fundamental para entender la variedad de señales que pueden evocarse. Experimentalmente es posible observar las señales usando los fluoróforos antes mencionados e induciendo la apertura de los canales con IP3 , que es introducido en la célula en forma enjaulada y posteriormente fotoliberado con luz ultravioleta. Otra de las contribuciones del presente trabajo de Tesis ha sido el diseño e implementación de una adaptación relativamente barata de un microscopio confocal Olympus FV1000 para realizar este tipo de experimentos. La habilidad del sistema para fotolizar compuestos enjaulados fue comprobada en distintas situaciones experimentales. Por otro lado, la potencia que llega a la muestra y el tamaño de la zona iluminada fueron cuantificados. Finalmente, en el trabajo se ha mostrado también que con esta adaptación es posible generar un est ́mulo preciso y controlado de IP3 simultáneamente a la obtención de imágenes confocales de señales de calcio, registrando y caracterizando a las mismas en ovocitos de Xenopus Laevis.

Identificador:

https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n4826_Sigaut