Mutaciones en la fructosa-1,6-bisfosfatasa de los cloroplastos para modificar su afinidad por metales y el pH óptimo de catálisis

Institución otorgante:

Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Fecha:

2007

Tipo de documento: 

info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
 

Formato:

application/pdf

Idioma:

spa

Temas:

FOSFOMONOESTERASAS - FOSFATASAS - FRUCTOSA-1,6-BISFOSFATASA - SCREENING FUNCIONAL - AFINIDAD POR METALES - PH OPTIMO - PHOSPHOMONOESTERASES - PHOSPHATASES - FRUCTOSE-1,6-BISPHOSPHATASE - FUNCTIONAL SCREENING - METAL AFFINITY - OPTIMUM PH

Descripción:

La fructosa-1,6-bisfosfatasa (FBPasa) es una enzima que cataliza la hidrólisis de la fructosa 1,6-bisfosfato para dar fructosa 6 fosfato y fosfato inorgánico (EC 3.1.3.11). Pertenece a una familia de fosfomonoesterasas que se caracterizan por el requerimiento estricto de un metal bivalente (principalmente Mg2+) que sirve como cofactor durante la catálisis. Además en mayor o menor medida todas son inhibidas por Li+. En esta tesis se trabajó con la FBPasa de cloroplastos (CFBPasa) de colza que integra el ciclo de Benson-Calvin cuya función principal es la fijación del dióxido de carbono. La luz modula la actividad del ciclo en el estroma del cloroplasto mediante (a) procesos de óxido/reducción y (b) la variación de la concentración de iones y metabolitos (e.g. Mg2+ y pH). La CFBPasa es clave en este proceso de regulación pues su actividad resulta fuertemente modificada por todos los factores antes mencionados. Nos propusimos investigar los mecanismos moleculares a través de los cuales la CFBPasa responde a las variaciones en las concentraciones de cationes y de pH. Para ello efectuamos dos ciclos de mutagénesis al azar y seleccionamos posteriormente las mutantes que exhibían un comportamiento diferente frente a la inhibición por Ca2+. Previamente fue necesario desarrollar un nuevo método de screening de la actividad fosfatasa que se distinguiese de los métodos reportados anteriormente por utilizar el sustrato específico de la enzima. Como resultado del screening funcional se obtuvieron principalmente tres mutantes, corroboradas por mutaciones sitio dirigida de la enzima nativa: 1) I271S: Presentó menor inhibición por Li+ respecto a la enzima nativa y su pH óptimo de catálisis se desplazó hacia regiones más alcalinas, característica relevante en la forma oxidada de la enzima. 2) I271S/A107V: La incorporación de la mutación A107V revirtió el pH óptimo de catálisis al de la enzima nativa. 3) A107V: Esta mutante presentó una mayor afinidad por el Mg2+ mientras que las demás propiedades bioquímicas fueron similares a las de la enzima nativa. El análisis de la posición estructural de las mutaciones y sus interacciones con el entorno nos llevó a postular fundamentalmente dos hipótesis: 1) Existe una hélice α que influye en el pKa del sitio activo. 2) Las interacciones hidrofóbicas de la Tyr305 (aminoácido que integra el motivo secuencial de las fosfomonoesterasas) son importantes para la regulación de la afinidad por metales.

Identificador:

https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n4115_Senn