Obtención y caracterización de anticuerpos monoclonales de isotipo IgM anti-lisozima de gallina

Institución otorgante:

Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Fecha:

2006

Tipo de documento: 

info:eu-repo/semantics/masterThesis
 

Formato:

application/pdf

Idioma:

spa

Descripción:

La inmunidad humoral es el mecanismo principal para la eliminación de microorganismos extracelulares y sus toxinas. Está mediada por anticuerpos (Acs)secretados por los linfocitos B (LB) circulantes y es la responsable del reconocimientoespecífico y la eliminación de los antígenos circulantes. La funcionalidad del sistemainmune humoral reside en su propiedad de producir un vasto rango de inmunoglobulinas distintas a partir de un repertorio genónmico limitado. En la primera etapa de la respuesta humoral primaria (primer encuentro del organismo con el antígeno foráneo), se producen anticuerpos de isotipo IgM, en unasegunda etapa se producen IgGs (IgGs tempranas). Para investigar algunos de losaspectos estructurales de las bases moleculares de la respuesta primaria hemoscaracterizado el AcMo FAAC79 y el AcMo Moi78 que reconocen en forma específicaa la lisozima de gallina (HEL). El primero fue obtenido en este plan y el segundofue producto de una fusión anterior. Ambos anticuerpos de isotipo IgM fueronpurificados a partir de LA, se ensayaron dos métodos de enriquecimiento, unode ellos fue la precipitación con agua a 4°C y otro método consistió en la precipitación con ácido bórico. Dichas IgMs fueron purificadas mediante precipitacióncon ácido bórico al 2% y exclusión molecular en FPLC, siendo éste el método que brindó mejor rendimiento. En un paso posterior se obtruvieron IgMm para estudios funcionales de afinidad frenteal antígeno mediante la técnica de biosensor a SPR. FAAC79 pudo ser caracterizadopresentando una kass de 6,35E3 M-1 S-1, una kdiss de 1.96E-3 s-1 y una KA de 1.89E6 M-1. el AcMo Moi78 no logró ser caracterizado debido a que no se pudoobtener una especie monovalente. Además hemos caracterizado sus estabilidades térmicas mediante DLS. Con el fin de establecer qué método de conservación y almacenamiento es el adecuado para los anticuerpos de isotipo IgM, hemos ensayado el agregadode trehalosa como crioprotector en el almacenamiento en solución a -20 °C y usando liofilización. Se evaluaron grado de agregación por DLS y actividad mediante ELISA. Considerando que el método de conservación tradicional es a -20°C se logró mejorar los resultados con el agregado de 0,2M de trehalosa como crioprotector y se encontró un método de conservación alternativo válidoque es la liofilización con el agregado de 0,8M de trehalosa. Además para completar la caracterización de dichos Acmos se procedió a clonary secuenciar su dominio variable mediante técnicas de Biología Molecular. Para el acMo Moi 78 hemos obtenido las secuencias de las cadenas VH y VLderivadas de las líneas germinales VH2c8, DQ52(BALB/c), JH3 y gm33, JK5respectivamente. VHMoi 78 presenta 9 mutaciones con respecto al gen VH2c8, 1de las cuales se encuentra en la juntura V-D (DQ52) y 7 inserciones (GGGGGGA) en el gen D, sin presentar mutaciones en el gen JH3. Para VL Moi 78 hemos econtrado 6 mutaciones con respecto al gen gm33, 2 de ellas en la juntura V-JK5 y 1 con respectoi al gen JK5. Desafortunadamente, no obtuvimos las secuencias codificantes para las cadenas VH y VL de FAAC79, pero fueron secuenciadas dos cadenas aberrantes derivadas de lascelulas NS0 usadas para obtener los anticuerpos monoclonales durante la fusión. Estos resultados están de acuerdo a otros previos aún no publicados por nuestro laboratorio.

Identificador:

https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n4027_Molinari