Estudio de los componentes del sistema de control de calidad de plegamiento de glicoproteínas en Trypanosoma Cruzi

Institución otorgante:

Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Fecha:

2007

Tipo de documento: 

info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
 

Formato:

application/pdf

Idioma:

spa

Temas:

RETICULO ENDOPLASMICO - N-GLICOSILACION - CONTROL DE CALIDAD DE PLEGAMIENTO - CHAPERONA - UDP-GLC-GLICOPROTEINA GLUCOSILTRANSFERASA - CALRETICULINA - CALCIO - CRUZIPAINA - TRYPANOSOMA CRUZI - ENDOPLASMIC RETICULUM - N-GLYCOSYLATION - FOLDING QUALITY CONTROL - CHAPERONES - UDP-GLC-GLYCOPROTEIN GLUCOSYLTRANSFERASE - CALRETICULIN - CALCIUM - CRUZIPAIN - TRYPANOSOMA CRUZI

Descripción:

El retículo endoplásmico (RE) es el compartimiento celular donde las proteínas que son secretadas o las que residen a lo largo de las vías endo y exocíticas o en la membrana plasmática se pliegan y sufren diversas modificaciones postraduccionales. Para evitar que las proteínas viajen por el camino secretorio sin haber adquirido su conformación nativa, el RE cuenta con sistemas de control de calidad de plegamiento (QC) capaces de distinguir los polipéptidos mal plegados y retenerlos en el RE para que eventualmente se plieguen o terminen siendo degradados. Uno de los principales sistema de QC depende de la presencia de un Nglicano unido a la proteína que se está plegando. El glicano que se transfiere cotraduccionalmente al polipéptido naciente en la mayoría de las células eucariotas tiene la estructura Glc3Man9GlcNAc2. Los dos primeros residuos de glucosa son escindidos por acción de las glucosidasas I y II (GI y GII). El glicano monoglucosilado resultante (G1M9N2) es reconocido por dos lectinas residentes del RE, la calnexina (CNX) y la calreticulina (CRT). Esta interacción se interrumpe cuando la GII remueve la glucosa restante pero puede restituirse gracias a la acción de otra enzima residente del RE, la UDP-Glc:glicoproteína glucosiltransferasa (GT). La GT vuelve a glucosilar sólo a aquellas glicoproteínas que no adquirieron su conformación nativa permitiendo su unión con las lectinas y así aumentando sus posibilidades de plegarse correctamente. En Trypanosoma cruzi se han identificado los tres componentes que forman el sistema de QC de glicoproteínas, GT, GII y CRT (este organismo no posee CNX). En este parásito, a diferencia de lo que ocurre en células de mamíferos, G1M9N2 sólo se forma por acción de la GT, puesto que el glicano transferido a las proteínas nascientes no contiene residuos de glucosa. Dada la gran importancia que diversas glicoproteínas poseen para el ciclo de vida de este parásito, se decidió estudiar si el facilitamiento del plegamiento mediado por CRT de la cruzipaína (CZ), uno de los factores de virulencia de T. cruzi, era esencial para la viabilidad, diferenciación y capacidad infectiva del parásito. Para ello, se identificó y secuenció el gen que codifica para la GT y se obtuvieron T. cruzi mutantes nulos para este gen. Así, se comprobó que la eliminación del sistema de QC de glicoproteínas no afectó el crecimiento de la forma epimastigote del parásito, aunque redujo la capacidad infectiva de la forma trypomastigote. El contenido celular de CZ sólo disminuyó parcialmente (5-20%) a pesar de que en células salvajes más del 90% de estas moléculas interaccionan con CRT. En los T. cruzi carentes de GT no pudo detectarse interacción entre CRT y CZ aún en condiciones muy suaves de inmunoprecipitación sin embargo se verificó un retraso en la llegada de la proteinasa a los lisosomas. Este retraso se debió a la inducción del sistema alternativo de QC basado en BiP/Grp78, cuya interacción con CZ se prolongó. Estos resultados ponen de manifiesto la gran plasticidad de la maquinaria de plegamiento del RE, la cual le permite al párasito sobreponerse a la falta del sistema de QC específico para glicoproteínas. Por otra parte, además de su función como chaperona, CRT es la principal proteína de unión de calcio en el RE. Dado que el nivel de calcio del RE fluctúa de forma considerable se estudió la relación entre ambas funciones de la CRT. La afinidad de CRT por G1M9N2 determinada por equilibrio de diálisis y por anisotropía de fluorescencia no se afectó con modificación de la concentración de calcio presente en el medio. La unión de CRT a neoglicoproteínas que presentan una conformación nativa o de tipo glóbulo fundido también fue independiente de la concentración del ión. En este mismo sentido, se comprobó que el calcio y G1M9N2 estabilizan a CRT frente a la desnaturalización térmica o inducida por urea de manera independiente y aditiva. Además, la capacidad de CRT de inhibir la agregación de IgY desnaturalizada tampoco se modificó al variar los niveles de calcio. En una aproximación in vivo, se observó que al disminuir los niveles de calcio del RE de T. cruzi no se altera la unión entre CRT y CZ. Estas observaciones demuestran que las funciones de chaperona y de unión de calcio de CRT son mutuamente independientes. Por último, se observó que la variación de los niveles de calcio del RE afectaba la localización subcelular de CRT, provocando un aumento de la concentración de esta en el citosol.

Identificador:

http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n4021_Conte