Identificación y caracterización de Mce3R, un regulador negativo de la transcripción del operón mce3 de Mycobacterium tuberculosis

Institución otorgante:

Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Fecha:

2006

Tipo de documento: 

info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
 

Formato:

application/pdf

Idioma:

spa

Temas:

M. TUBERCULOSIS - MCE - TETR - REGULACION - VIRULENCIA - M. TUBERCULOSIS - MCE - TETR - REGULATION - VIRULENCE

Descripción:

La Tuberculosis (TB) es una de las enfermedades infecciosas más antiguas y a pesar de la existencia de una vacuna Bacille Calmette-Guérin (BCG) y de un tratamiento con antibióticos, un tercio de la población mundial está infectada con Mycobacterium tuberculosis, el agente etiológico de la TB. Aproximadamente ocho millones de nuevos casos son diagnosticados anualmente y la tasa de mortalidad es de dos millones por año (World Health Organization, 2002). A partir del análisis de la secuencia del genoma de M. tuberculosis, se identificaron cuatro regiones genómicas homólogas denominadas operones mce (por mammalian cell entry) 1, 2, 3 y 4 (Cole et al., 1998). Codifican para ocho proteínas secretadas o de membrana, similares en secuencia y organización y con una alta homología entre ellos. La proteína con características de invasina descripta por Riley y colaboradores es la denominada Mce1A (Arruda et al., 1993). Hacia el extremo 5’ de la unidad transcripcional, se encuentran los dos genes yrbE A y B que codifican para proteínas integrales de membrana. Los seis genes siguientes de cada operón (mceA-F), están relacionados y poseen motivos conservados y una organización común. Estos operones se encuentran ampliamente distribuidos en el género y su presencia fue demostrada en especies micobacterianas no tuberculosas MOTT (Mycobacterium other than tuberculosis), incluyendo M. avium y M. smegmatis (Haile et al. 2002). La presencia de los operones mce en M. smegmatis una cepa saprofítica, parecería indicar que la presencia o ausencia no se correlaciona con patogenicidad, pero una diferencia en los perfiles de expresión sí podría tener importancia en las micobacterias patógenas. Por otro lado, cuando se bloquea la expresión de algunos genes mce en M. tuberculosis, el bacilo pierde capacidad de multiplicar y persistir in vivo con una disminución en las UFC en bazo y pulmón de ratón (Gioffré et al., 2005). Kumar y colaboradores (2003) demostraron que la expresión de los operones mce varía espacial y temporalmente. La presencia de genes reguladores en las cercanías de tres de los cuatro operones Rv0165c del operón mce1, Rv0586 del operón mce2 y Rv1963c del operón mce3, indicaría que existe un mecanismo que controla el nivel de expresión de los genes mce y que el mismo podría ser la clave que determina la asociación de los operones mce con la virulencia de las micobacterias patógenas. Adyacente a los genes Rv1964- Rv1971, que conforman el operón mce3, y en sentido contrario al de la transcripción se encuentra Rv1963c (Mce3R) que codifica para un putativo regulador transcripcional de la familia TetR. Ya que los reguladores transcripcionales suelen regular la expresión de genes cercanos, fue de interés en este trabajo estudiar el rol de dicho gen en la regulación de la expresión del operón mce3. Los experimentos de geles de retardo realizados con diferentes sondas evidenciaron una unión específica de la proteína que codifica Rv1963c (Mce3R) al promotor del operón mce3, P3-200. Más consistentemente, los ensayos de regulación utilizando el gen lacZ como reportero en las cepas de M. smegmatis y M. tuberculosis, mostraron que la actividad promotora de P3 es mucho menor en presencia de la proteína Mce3R que en ausencia de la misma. Y por último, la eliminación de mce3R en M. tuberculosis (Δmce3R), resultó en un incremento significativo en el nivel de mRNA del operón mce3. Por lo tanto es posible concluir que Mce3R regula negativamente la transcripción del operón mce3 por unión a la región promotora. Dicha región fue definida dentro de las 206pb (P3-200) ubicadas río arriba del codón de iniciación del gen Rv1964 mediante deleciones de la región intergénica y determinación de la actividad promotora por fusión a β-galactosidasa. En la misma región P3-200 se identificó mediante geles de retardo, footprinting, mutagénesis dirigida y el uso del gen reportero la región operadora tetO’ a la que se une Mce3R y se definió el consenso tet al que se une en M. tuberculosis. A partir del mismo fue posible predecir otros genes putativos blancos de Mce3R y proponer una posible función para los genes mce. El alto grado de conservación entre los genes mce plantea la posibilidad de que Mce3R actúe regulando la expresión de los operones mce1, 2 y 4. En este trabajo se determinó mediante la utilización de un reportero y QRT-PCR que Mce3R no regula los otros operones en las condiciones estudiadas. Por otro lado la mutante obtenida en el gen mce3R (Δmce3R) abre el camino hacia la exploración de este sistema de regulación mediante el empleo de tecnologías de genómica funcional. Finalmente, se ha estudiado y caracterizado un sistema de expresión inducible que podrá ser usado como herramienta en el estudio de regulación y función de genes y la obtención de mutantes condicionales.

Identificador:

https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n4010_Santangelo