Desarrollo de partículas semejantes a virus (VLPs) basadas en al proteína VP6 de rotavirus como sistema de presentación de antígenos heterólogos

Institución otorgante:

Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Fecha:

2006

Tipo de documento: 

info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
 

Formato:

application/pdf

Idioma:

spa

Descripción:

En este trabajo de tesis se ha ensayado la presentación de secuencias aminoacídicas heterólogas en la superficie de partículas semejantes a virus derivadas de la proteína VP6 de rotavirus para usos biotecnológicos. Para esto, se seleccionaron nueve sitios de inserción en la proteína VP6, que corresponden a las posiciones aminoacídicas 1,14, 101, 146, 171, 235, 301/308, 358, y 382 mediante algoritmos que predicen hidrofilicidad y antigenicidad, así como a partir de datos cristalográficos. A través de mutagénesis dirigida por PCR se insertó un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción XbaI en la secuencia de VP6 que permitió el clonado posterior de un epitope de 14 aminoácidos derivado del paramixovirus SV5, originando así las distintas versiones VP6-V5. De las distintas quimeras expresadas en células de insecto infectadas con baculovirus recombinantes se determinaron los niveles de expresión alcanzados, su capacidad de trimerización, su capacidad de multimerización, sus propiedades antigénicas, su interacción con la proteína VP2 y su inmunogenicidad en animales de laboratorio. La inserción del epitope V5 en las posiciones 171, 235 y 301/8 impidió la formación de trímeros, mientras que la inserción de la secuencia heteróloga en las posiciones 358 y 382 afectó seriamente la capacidad de multimerizar, lo que no pudo ser revertido por la coexpresión de la proteína VP2, que estabiliza las estructuras multiméricas. Los resultados obtenidos aportan datos que ayudan a caracterizar con mayor precisión los dominios de trimerización y de multimerización de la proteína VP6, acotando el dominio de trimerización a los aminoácidos 171 y 328 y el de multimerización, a los aminoácidos 315 a 397. Por otro lado, la versión VP6/V514 no fue reconocida por distintos sueros policlonales anti-VP6, mientras que sí lo fue por un anticuerpo monoclonal anti-V5, indicando que mediante la inserción de una secuencia en esta posición se interrumpe el sitio antigénico lineal inmunodominante de la proteína VP6. La caracterización estructural de los multímeros VP6/V5 mediante gradientes de CsCl, microscopía electrónica y ensayos de ELISA sandwich reveló que la inserción del epitope V5 en la posición 171 de VP6 produce las VLPs quiméricas más estables y que exponen el epitope heterólogo en su superficie. La inmunización de ratones con la mayoría de las quimeras VP6/V5 en su estado monomérico resultó en la inducción de una sólida respuesta humoral contra el epitope V5, que dependió de la posición de éste en la proteína carrier y que se mantuvo constante hasta los 150 días de iniciado el experimento. Un resultado similar se obtuvo cuando se inmunizaron ratones con las quimeras VP6/V5 en estado multimérico, en particular, con la versión VP6/V514. En este caso, es notable remarcar que se obtuvo una sólida respuesta humoral contra el epitope V5 aún utilizando sólo 30 ng de proteína quimérica como inmunógeno, lo que equivale a utilizar 0,9 ng de péptido V5. Se puede concluir que los resultados obtenidos en este trabajo de tesis aportan valiosos datos a la caracterización antigénica y estructural de la proteína VP6 de rotavirus, los que permitieron identificar sitios de inserción de secuencias heterólogas que pueden utilizarse en la producción de VLPs quiméricas capaces de inducir sólidas respuestas inmunes humorales contra el epitope transportado, a dosis muy bajas.

Identificador:

https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3935_Peralta