Caracterización molecular del Mal de Río Cuarto virus (MRCV) del maíz : estudio de los segmentos genómicos S1-S6, S8 y S10 y de las proteínas codificadas por los mismos

Institución otorgante:

Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Fecha:

2003

Tipo de documento: 

info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
 

Formato:

application/pdf

Idioma:

spa

Temas:

MAL DE RIO CUARTO - MRCV - FIJIVIRUS - REOVIRIDAE - DSRNA - RNA POLIMERASA DEPENDIENTE DE RNA - PROTEINA MAYORITARIA DE CAPSIDE INTERNA - PROTEINA DE CAPSIDE EXTERNA - MAL DE RIO CUARTO DISEASE - MAL DE RIO CUARTO VIRUS - MRCV - FIJIVIRUS - REOVIRIDAE - DSRNA - RNA DEPENDENT RNA POLYMERASE - MAJOR CORE CAPSID PROTEIN - OUTER SHELL CAPSID PROTEIN

Descripción:

El Mal de Rio Cuarto es la principal enfermedad del maíz en la Argentina. Es causado porel Mal de Río Cuarto virus (MRCV) y transmitido por una chicharrita de la especie Delphacodes kuscheli. El MRCV pertenece a la familia Reoviridae, género Fijivirus, ytiene la propiedad de multiplicar tanto en plantas de maíz como en el insecto vector. Lasparticulas virales consisten en una cápside icosahédrica formada por una doble capa deproteínas y contiene en su interior lO segmentos genómicos de RNA de doble cadena (dsRNA) llamados Sl a SlO, siendo el tamaño del genoma de aproximadamente 29 kbp. En los últimos años, y en muchos casos en paralelo con el desarrollo de éste trabajo, sehan reportado las secuencias de algunos segmentos de virus relacionados: el MRDV (Maize rough dwarf virus), el FDV (Fiji disease virus), el ODSV (Oat sterile dwarf virus),el genoma completo del RBSDV (Rice black streaked dwarf virus) y del NLRV (Nilaparvata lugens reovirus). En este trabajo se clonaron, secuenciaron y analizaron los segmentos genómicos Sl, S2, S3, S4, S5, S6, S8 y SlO completos del MRCV. Se determinó que todos los segmentosgenómicos analizados poseen secuencias 5’ y 3’ terminales conservadas y característicasdel serogrupo al cual pertenece el MRCV: 5’AAGUUUUU3’ (extremo 5’) y 5’CAGCUnnnGUC3’ (extremo 3’). Adyacente a los extremos conservados se encuentranrepeticiones de 7 a 12 nucleótidos invertidas e imperfectas que son segmento específicas. La predicción de la estructura secundaria de las cadenas codificantes de todos lossegmentos estudiados, muestra que las regiones terminales son capaces de formarestructuras secundarias determinadas y estables que fueron propuestas como señales dereplicación y empaquetamiento en virus del género Rotavirus. Se compararon las secuencias de nucleótidos obtenidas y las secuencias de aminoácidosdeducidas con las secuencias de otros reovirus depositadas en las bases de datos, y seidentificó la presencia de motivos característicos, a menudo indicativos de función. Sedeterminó que el MRCV Sl codifica para una proteína básica de 168,4 kDa que contienemotivos conservados en las RNA polimerasas dependientes de RNA y es homóloga a las RNA polimerasas codificadas por los virus RBSDV, FDV y NLRV, asi como a lascodificadas por miembros de otros géneros de la familia Reoviridae. El MRCV S2codifica para una proteína de 134,4 kDa y posee homología con las proteínas codificadaspor el RBSDV S4, el FDV S2 y NLRV S2. En este trabajo presentamos evidencias de quela proteína codificada en éste segmento es no estructural. El MRCV S3 codifica para unaproteína de 141,7 kDa, y hemos demostrado que es la proteína mayoritaria de la cápsideinterna o “core” viral y posee una alta homología con las proteínas correspondientescodificadas por el RBSDV S2 y FDV S3. El MRCV S4 codifica para una proteina de 131,7 kDa y su función se desconoce. Presenta una relativamente alta homología conmiembros del género Fijivirus como así también con otros miembros de la familia Reoviridae. El MRCV S5 codifica para una proteína de 106,9 kDa cuya función sedesconoce. Esta proteína presenta homología con las proteínas codificadas por lossegmentos S5 del RBSDV y del FDV. El MRCV S6 codifica para una proteína de 90 kDacuya función se desconoce. Esta proteína presenta una llamativa baja homología con lasproteínas codificadas por los segmentos S6 del RBSDV y del FDV. El MRCV S8 codificapara una proteína de 68,3 kDa que contiene un motivo de unión de ATP/GTP que escaracterístico de helicasa. Además la proteína es homóloga con las proteínas codificadaspor el RBSDV S8, el MRDV S7, el OSDV S9 y el NLRV S7, todas con probable funciónde helicasa. El MRCV SlO codifica para una proteína de 63,5 kDa y su probable funciónsería la de proteína de cápside externa. Esta proteína presenta una alta homología con lasproteínas correspondientes codificadas por los segmentos SlO de los virus RBSDV, MRDV y FDV. El análisis de los valores de homología encontrados entre los distintossegmentos del MRCV y los segmentos de virus relacionados, apoyaría la idea de evoluciónindependiente de cada segmento viral. El análisis filogenético realizado con las secuencias obtenidas del MRCV permitióproponer que a pesar de que el MRCV está relacionado con el MRDV y el RBSDV, debeser considerado una especie diferente del género Fijivirus (Distéfano y col., 2002) y no unaraza geográfica del MRDV, como había sido inicialmente propuesto. El análisisfilogenético realizado con las secuencias de aminoácidos de polimerasas representativas detodos los géneros de la familia Reoviridae mostró la existencia de dos grupos evolutivosseparados: uno agrupa a los Orthoreovirus, Aquareovirus, Orbivirus y Rotavirus, y otroagrupa a los Fijivirus, Cypovirus, Olyzavirus y Coltivirus. Se expresaron algunos de los segmentos virales en estudio en bacterias obteniéndoseproteínas de fusión con un péptido rico en histidinas que facilita su posterior purificación. Se obtuvieron antisueros policlonales contra las proteínas codificadas por los segmentos S2, S3, S4 y S6. El antisuero obtenido contra la proteína codificada por el MRCV S3 fuecapaz de reconocer específicamente una de las proteína estructurales presentes enpartículas virales purificadas del MRCV en un ensayo de “Western blot”. Esta proteinacorrespondería a la proteína mayoritaria de la cápside interna o “core” viral. En unexperimento complementario, un antisuero obtenido contra las proteínas de la partículaviral fue capaz de reconocer a la proteína del MRCV S3 expresada en bacterias. Asimismoel antisuero obtenido contra la proteína codificada por el MRCV S3 reconoce una proteínade tamaño similar al esperado en extractos de plantas enfermas. Mediante experimentos deinmunomicroscopía electrónica sobre cortes de hojas de maíz infectadas el con MRCV seconfirmó que la proteína codificada por el S3 del MRCV es una proteína estructural delvirus y se demostró que forma parte del “core” viral El antisuero obtenido contra la proteína codificada por el MRCV 82, reconocióespecíficamente a una proteína de menor tamaño al esperado en extractos proteicos totalesde plantas enfermas. Mediante experimentos de inmunomicroscopía electrónica sobrecortes de hojas de maíz infectadas el con MRCV se confirmó que la proteína codificadapor el S2 del MRCV seria una proteína no estructural presente en los viroplasmas. En experimentos de “Far-Western blot” se observó que la proteína codificada por el MRCV S3 era capaz de interactuar consigo misma, con una proteína de 130 kDa quecorrespondería a la espícula viral de tipo B y con la RNA polimerasa dependiente de RNAcodificada por el MRCV Sl. En Rotavirus se demostró que las proteínas equivalentesinteraccionan entre sí. Los resultados presentados en este trabajo contribuyeron al avance en el estudio del virusque causa la enfermedad del Mal de Río Cuarto, a la clasificación taxonómica del mismo yal estudio de su origen evolutivo. Además los datos obtenidos permitieron el diseño de unaestrategia de resistencia al MRCV en plantas transgénicas de maíz basada en eldesencadenamiento del silenciamiento génico post-transcripcional (PTGS).

Identificador:

https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3687_Distefano