Caracterización farmacológica y biofísica de los receptores ionotrópicos de Gaba

Institución otorgante:

Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Fecha:

2003

Tipo de documento: 

info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
 

Formato:

application/pdf

Idioma:

spa

Descripción:

El ácido γ-aminobutírico (GABA) es el principal neurotransmisor inhibitorio del sistema nervioso central devertebrados y hasta el momento se han caracterizado tres tipos de receptores de GABA, según sus propiedadesfarmacológicas: GABAa, GABAb y GABAc. Los receptores de GABAa (GABAaR) y GABAc (GABAcR) compartenademás su mecanismo de señalización, ambos son receptores ionotrópicos con una alta permeabilidad a iones cloruro. Los receptores de GABAb son metabotrópicos, generalmente acopladas a proteínas G. En esta tesis se presenta una extensa caracterización de las propiedades farmacológicas y biofísicas de los receptoresde GABA, con especial énfasis en los GABAcR Este subtipo de receptores de GABA fue el último en ser identificadoy se caracteriza por su insensibilidad al antagonista clásico GABAérgico, bicuculina y por el lento curso temporal desus respuestas. Este trabajo se realizó expresando los receptores en ovocitos de Xenopus laevis y estudiando suspropiedades con dos diferentes técnicas electrofisiológicas: fijación de voltaje con dos electrodos (FVDE) y patchclampen la configuración outside out. Los receptores ionotrópicos de GABA (GABA-R) son modulables por una diversidad de compuestos de diferentenaturaleza química. Entre ellos se encuentran los flavonoides (F), una familia de compuestos aislados de plantasvasculares que presentan una gran variedad de acciones neurofarmacológicas. Algunos son ansiolíticos y sedantes, y seha propuesto que su mecanismo de acción sería a través de los GABAaR. En este trabajo, evaluamos la acción de ungrupo de F sobre las respuestas mediadas por GABA-R. Los F utilizados en este trabajo fueron: quercetina, crísina,apígenina, morina, flavona y α-naftoflavona. Contra lo esperado, los F evaludados tuvieron un efecto inhibitoriogeneral tanto sobre los GABAaR como los GABAcR. Quercetina fue el más potente para ambos receptores con un IC50de aproximadamente 4 µM en cada caso. También se evaluó la acción de quercetina en otros receptores ionotrópicos deneurotransmisores, como los colinérgicos nicotínicos, serotonina y kainato. En todos ellos se observaron efectosinhibitorios con distinta potencia. Tanto los GABAaR como los GABAcR son sensibles al alcaloide picrotoxina. Se han propuesto distintosmecanismos para su acción sobre los GABAaR incluyendo efectos no-competitivos y mixtos. Sin embargo, aún no seha esclarecido suficientemente el mecanismo de acción en los GABAcR. Picrotoxina produjo una inhibición reversiblecon un IC50 = 0.6 ǂ 0.1 µM. La curva dosis-respuesta (D-R) para GABA en presencia del antagonista (1, 10 y 100 µM)sufrió un desplazamiento hacia la derecha y para las concentraciones más altas de esta toxina, una reducción en larespuesta máxima. Este resultado sugeriría un mecanismo de acción de tipo no-competitivo. No obstante, al igual quelos antagonistas competitivos, las respuestas a concentraciones bajas de GABA fueron más sensibles a picrotoxina quelas más altas. La inhibición por esta toxina fue también dependiente del uso, es decir, requirió la activación de losreceptores para ejercer su efecto. La recuperación de la inhibición también fue facilitada por la acción de GABA. Además, picrotoxina produjo un aumento en la velocidad de de-activación de las respuestas al GABA, sugiriendo unmecanismo de tipo no-competitivo. En resumen, la inhibición de los GABAcR por picrotoxina tendría un mecanismode acción no-competitivo o mixto, y dependiente del uso aunque menos que los GABAaR. Los GABAcR son sensibles a la modulación por iones trivalentes de la serie de los lantánidos (L) que producen unincremento en las respuestas a GABA. En un estudio previo se caracterizó la acción de uno de los elementospertenecientes a los L, lantano (La³+); mientras que en este trabajo se analizaron los efectos de otro, lutecio (Lu³+). Yaen experimentos preliminares, se observó que la acción de Lu³+ sería más compleja ya que produjo un aumento rápidode la corriente, seguido de una atenuación durante la aplicación del ión sobre la respuesta a GABA. Lu³+ provocó unaaumento en la afinidad aparente por GABA (0.4 ǂ 0.1 µM) y un incremento en la respuesta máxima a concentracionessaturantes de agonista. También se evaluó cómo afectaba la presencia de Lu³+ a la acción de ciertos antagonistas, comoparámetro de la función de los GABAcR. El antagonista competitivo, TPMPA, inhibió las respuestas evocadas por GABA en presencia de Lu³+ con una potencia semejante a lo observado en ausencia de este ión. No obstante, no tuvoun efecto protector de la atenuación de la respuesta mediada por Lu³+, sugiriendo que este proceso sería operado poreste ión independientemente de GABA. Las respuestas evocadas en presencia de Lu³+ también fueron sensibles apicrotoxina pero con caracteristicas diferentes a lo ya descripto. Se elaboró, además, un modelo de gating de los GABAcR y de la acción de Lu³+, donde se propone la existencia de dos estados abiertos, revelado por la presencia deeste ión, que además mediaría un proceso de desensibilización independiente de GABA. Los estudios existentes sobre la cinética de los GABAcR fueron hechos con técnicas de pobre resolución temporal, ypor esto decidimos realizar esta serie de experimentos en parches de membrana con la técnica de patch-clamp en laconfiguración outside out. Las respuestas al GABA obtenidas con esta metodología presentaron un curso temporalcaracterístico de los GABAcR: activación y de-activación lentas, de varios segundos de duración, con escasadesensibilización. La afinidad aparente por GABA calculada fue 4.0 ǂ 0.8 µM con un n de Hill = l.7 ǂ 0.5. La relacióncorriente-voltaje fue lineal, y el canal mostró una permeabilidad alta a cloruro. Se evaluó la sensiblidad de los GABAcR en parches de membrana a una serie de agonistas (TACA, β-alanina, glicina), antagonistas (TPMPA,picrotoxina, quercetina, zinc) y moduladores (La³+ y Lu³+) conocidos. Todos estos produjeron efectos similares aldescripto previamente. Un estudio más profundo de la cinética de de-activación de las respuestas mostró que aconcentraciones altas de agonista, la relajación era mejor descripta por ecuación de decaimiento exponencial desegundo orden; mientras a dosis cercanas al EC50,de primer orden. Esto sugeriría un modelo de gating con dos estadosabiertos con distinta cantidad de moléculas de agonista unido, que fue evaluado realizando simulaciones numéricas dela actividad del receptor.

Identificador:

https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3635_Goutman