Construcción y caracterización de estructuras complejas de biomoléculas con aplicación en el diseño de biosensores

Institución otorgante:

Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Fecha:

2003

Tipo de documento: 

info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
 

Formato:

application/pdf

Idioma:

spa

Temas:

PELICULAS AUTOENSAMBLADAS - ELECTRODOS ENZIMATICOS E INMUNOLOGICOS - MICROBALANZA DE CRISTAL DE CUARZO - PROPIEDADES VISCOELASTICAS - AVIDINA-BIOTINA - ANTIGENO-ANTICUERPO - SELF-ASSEMBLED MULTILAYERS - ENZYMATIC AND IMMUNOLOGICAL ELECTRODES - QUARTZ CRYSTAL MICROBALANCE - VISCOELASTIC PROPIERTIES - AVIDIN-BIOTIN - ANTIGEN-ANTIBODY

Descripción:

Un biosensor es un dispositivo de reconocimiento moleculardonde una biomolécula interactúa en forma altamente específica con unanalito y donde el cambio químico producido en presencia del analito setraduce en una señal eléctrica procesable. Una de las etapas másimportantes en el diseño de un biosensor es la de generar unaestructura o superestructura, en la cual estén insertas las biomoléculasresponsables de la respuesta del sensor. De esta etapa dependerán laactividad de la biomolécula, la sensibilidad, la especificidad y el ámbitode uso del biosensor. En este trabajo de tesis se estudiaron diversos aspectos de lainmovilización de enzimas y anticuerpos en el contexto de laconstrucción de electrodos enzimáticos para la detección de glucosa yde la construcción de sensores inmunológicos para detectar moléculaspequeñas a través de un ensayo competitivo. Para ello se utilizaron enforma complementaria distintas técnicas como la Microbalanza de Cristal de Cuarzo (QCM), la Elipsometría, la Microscopía de Fuerza Atómica (AFM)y diversas Técnicas Electroquímicas. Como técnicas de inmovilización se utilizaron la funcionalizacióncovalente de superficies, el autoensamblado electrostático, el empleo deuniones de importancia biológica como avidina-biotina o antígeno-anticuerpoen la inmovilización de enzimas y el uso de proteínasorientadoras como proteína A y proteína G para la inmovilización deanticuerpos. En primer lugar se describe el uso de la microbalanza de cristalde cuarzo para estudiar sistemas autoensamblados en multicapas deglucosa oxidasa (GOx)y polialilamina derivatizada covalentemente conun complejo de Os: [Os(bpy)2ClPyCOH]+, (PAH-Os), depositadas sobresuperficies de oro modificadas con ácido 3-mercaptopropansulfónico (MPS). Las etapas de adsorción del polímero y la glucosa oxidasa serepitieron alternadamente obteniendo cristales de cuarzo modificadoshasta con 14 bicapas de polímero-enzima. El espesor elipsométrico,determinado a tres longitudes de onda, y la masa de las películasautoensambladas, determinadas por QCM en condicionesgravimétricas, se determinaron en contacto con solución de electrolito yen condiciones de sequedad y se estimó a partir de dichas mediciones ladensidad de la película en ambas condiciones. Se plantea en esta tesis una estrategia general para la extracciónde las propiedades viscoelásticas de peliculas autoensambladas porcombinación de QCM y elipsometría. Por combinación del espesor ydensidad estimados de la película, la expresión de la impedanciamecánica superficial del cristal de cuarzo, y la viscosidad y densidad delelectrolito, se pudieron estimar los valores de los módulos dealmacenamiento (G') y perdida (G") a 10 MHz para una películaautoensamblada como función del espesor y el potencial de electrododurante dos tipos de perturbaciones electroquímicas: voltametría cíclicay saltos de potencial. Una vez planteada la utilidad de ambas técnicas, QCM yelipsometría en el estudio de la construcción de películasautoensambladas, éstas se emplearon para el estudio del crecimiento depelículas autoensambladas de glucosa oxidasa biotinizada y PAH-Osutilizando dos estrategias distintas de inmovilización de la enzima: laformación de una unión antígeno-anticuerpo y la formación de unaunión avidina-biotina. Se estudió la cinética de adsorción de lasbiomoléculas y el grado de inespecificidad de las interacciones durantela inmovilización de la enzima. Se estudió además el comportamientobiocatalítico de la glucosa oxidasa biotinizada inmovilizada en lasdistintas estructuras autoensambladas y se llegó a la conclusión de quela eficiencia de la comunicación eléctrica entre las enzimas y elmediador se ve afectada tanto por el tipo de inmovilización de la enzima,como por la cantidad de centros redox del polímero de osmio por cadamolécula de enzima. Las enzimas redox inmovilizadas en estructurasautoensambladas no solamente tienen aplicación en el diseño deelectrodos enzimáticos, sino también en el desarrollo de biosensoresinmunológicos. La formación de una unión antígeno-anticuerpo nogenera una señal medible por lo cual se recurre al uso de sustanciasmarcadoras. La mayor parte de los inmunoelectrodos desarrolladosúltimamente están basados en el uso de enzimas oxidoreductasas comomarcadoras. Además de los marcadores es necesario utilizarmediadores redox para transferir la carga entre el electrodo y el sitioredox de la enzima y revelar la actividad enzimática a través de la señaldel mediador. De este modo la superficie del electrodo representa, tantoel transductor para la detección enzimática, como el soporte inertesobre el cual se inmovilizan los antígenos o los anticuerpos. En estecontexto se construyeron multicapas autoensambladas de PAH-Os y unanticuerpo, IgG antibiotina, con el objetivo de construir un biosensormodelo para la detección de moléculas pequeñas (como la biotina) através de un ensayo competitivo, utilizando un marcador enzimáticobasado en peroxidasa de rábano, HRP-biotina. Con la técnica de EQCMse estudió la deposición de las multicapas, es decir la cantidad de IgGdepositada en cada capa, los cambios viscoelásticos durante laadsorción, la cinética de adsorción para distintas concentraciones de IgG y el pegado del marcador o conjugado HRP-biotina. Con la técnicade AFM se observó la estructura y orientación de las moléculas de IgGadsorbidas sobre el polímero y finalmente con las técnicaselectroquímicas se estudió el crecimiento de las bicapas y la utilidad dela supraestructura como biosensor, a través del estudio de la catálisisenzimática del conjugado. Finalmente se describen resultadospreliminares sobre el uso de proteínas orientadoras, proteína A y G’,utilizadas para disminuir la inespecificidad del sensor y favorecer lareacción entre el antígeno y el anticuerpo inmovilizado. En conclusión, los resultados obtenidos confirman que lainmovilización de biomoléculas es por cierto una de las etapas másimportantes en el desarrollo de un biosensor al afectar la respuesta delmismo. Además se muestra la necesidad de recurrir a distintas técnicaspara su estudio y de este modo contrarrestar las limitaciones propias decada técnica.

Identificador:

https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3562_Otero