Caracterización bioquímica y molecular de los sitios de unión a zona pellucida presentes en proacrosina humana

Institución otorgante:

Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Fecha:

2002

Tipo de documento: 

info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
 

Formato:

application/pdf

Idioma:

spa

Temas:

FECUNDACION - ESPERMATOZOIDE - OVOCITO - ACROSOMA - ZONA PELLUCIDA - ACROSINA

Descripción:

El presente trabajo tuvo como objetivo estudiar el rol de la proteina espermáticahumana proacrosina/acrosina como molécula de adhesión a las glicoproteínas de lazona pellucída (ZP). En una primera etapa, se llevó a cabo un análisis bioinformático sobre lasecuencia aminoacídica de proacrosina con el propósito de identificar sitiospotenciales de unión a glicoproteínas de la ZP. El resultado de este análisis reveló quelos residuos Lys74. Lys169, Arg172, Arg199, Arg249, Lys251, Arg252 y la secuencia KRLQQKLIE, localizada entre los residuos 367-374, conformarían sitios potenciales deunión a la ZP. A continuación se realizaron experimentos para evaluar la interacción entreproacrosina/acrosina con glicoproteínas de la ZP. Para ello se desarrolló unaestrategia de subclonado del ADNc de proacrosina humana en vectores de expresiónprocariotas (pET-22b, pGEX-3X) para la expresión de proacrosina recombinante. Utilizando el sistema de expresión en forma directa (pET-22b) se obtuvo un productode expresión recombinante correspondiente a la proenzima (Rec-40), y productostruncados del extremo N-terminal de la proteína (Rec-30, Rec-20, Rec-10). Estasproteinas fueron caracterizadas mediante la utilización de anticuerpos especificos yanálisis de secuenciación de aminoácidos, determinándose que Rec-30correspondería a los residuos 1-300, Rec-20 a 1-190 y Rec-10 a 1-160 de proacrosinahumana. Utilizando el mismo sistema de expresión se sintetizó un producto deexpresión correspondiente a los residuos 1-59 de proacrosina (Rec-6). Los productosde expresión, obtenidos como cuerpos de inclusión, fueron solubilizados y aisladosmediante electroforesis preparativa. El estudio de la interacción entre proacrosina/acrosina recombinante y lasglicoproteínas de la ZP se llevó a cabo utilizando ensayos de unión en fase sólida ("Ligand blot", "Dot blot", ensayo en placa de poliestireno). Se utilizaron glicoproteínasobtenidas de ovocitos humanos de descarte de programas de fecundación in vitro, asícomo glicoproteínas obtenidas por expresión en células CHO a partir del ADNc (rec-hZPA,rec-hZPB, rec-hZPC). El resultado de estos estudios indicó que proacrosinarecombinante (Rec-40) y fragmentos del extremo N-terminal de la proteína (Rec-30, 20y 10) tienen capacidad de unión a glicoproteínas de la ZP y a azúcares. Lasglicoproteínas de la ZP mostraron diferente capacidad de unión aproacrosina/acrosina, siendo hZPA el ligando principal. El mecanismo de unióninvolucraría interacciones electrostáticas entre aminoácidos cargados positivamenteen proacrosina/acrosina, y oligosacáridos sulfatados en la ZP, así como elreconocimiento de residuos de fucosa y manosa presentes en los oligosacáridos de la ZP. El resultado del mapeo de los sitios de unión en la molécula de proacrosinapermite proponer que éstos estarían localizados en dos regiones de la proteína. Unaregión estaría comprendida entre los residuos 59-160 (Dominio II), y otra entre losresiduos 300-402 (Dominio III). Los sitios de unión localizados en el Dominio II de laproteina estarían estabilizados por uniones no covalentes y puentes disulfuro, mientrasque los sitios localizados en el Domino II estarían estabilizados por interacciones nocovalentes, y tendrían una contribución principal a la afinidad de la interacción. Endichas regiones, los residuos Lys74, Lys108, Lys114 y el motivo KRLQQKLIE (residuos 367-374), identificados mediante el análisis de secuencias, participarían enla interacción con glicoproteinas de la ZP y azúcares. En resumen, este trabajo muestra que proacrosina/acrosina humana presenta La capacidad de reconocer glicoproteinas de la ZP. de manera independiente de laactividad de proteasa. Esto permite proponer que proacrosina/acrosina participaríacomo molécula de adhesión en la unión secundaria del espermatozoide a la ZP en elhumano.

Identificador:

https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3514_Furlong