Represión de la expresión génica mediante el secuestro de un coactivador : Transducción de la señal y elementos involucrados en la regulación ejercida por ésteres de forbol sobre el promotor del gen 5-aminolevulinato sintetasa

Institución otorgante:

Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Fecha:

2002

Tipo de documento: 

info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
 

Formato:

application/pdf

Idioma:

spa

Descripción:

Los factores de transcripción AP-1 (Activation protein-1) son genes tempranosinvolucrados en gran diversidad de procesos regulatorios. El éster de forbol 12-O-tetradecanoilforbol-l3-acetato (TPA) es utilizado habitualmente para inducir la actividad de AP-1 y proteinquinasa C (PKC). El propósito de este trabajo es explorar los mecanismosmoleculares involucrados en la regulación por TPA de la expresión del gen de 5-aminolevulinatosintetasa (ALAS), la primer enzima y determinante de velocidad de labiosíntesis de hemo. Análisis previos de la secuencia 5’ flanqueante revelaron la existencia de dos elementosde respuesta a cAMP (CRE) requeridos para la expresión basal y estimulada por CAMP. Elfragmento —833a +42 en la región 5’flanqueante del gen de ALAS de rata, fue subclonado enun vector con el gen reporter cloranfenicol acetiltransferasa (CAT). El vector de expresión,pALAS/CAT, produjo una significativa actividad CAT en células de hepatoma humano HepG2 transfectadas transientemente, que fue reprimida por TPA. Mediante análisis desecuencias y deleciones dctectamos un elemento de respuesta a TPA (TRE), localizado entre —261 y -255 que según establecimos por mutagénesis, es crítico para la regulación por TPA. Demostramos que c-Fos, c-Jun y JunD están involucrados en el efecto inhibitorio por suhabilidad de interactuar con TRE-ALAS, como evidenciamos por análisis de supershift y sucapacidad para reprimir la actividad del promotor en ensayos de transfección. Demostramos la participación de componentes de diferentes vías de señalización. Seencuentran involucradas la isoforma α de la PKC, la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K), laquinasa regulada por señales extracelulares (ERK 1/2) y la quinasa N-terminal de c-Jun (JNK). Asimismo, presentarnos a la quinasa p90RSK2 como un posible punto deconvergencia de las vías de PI3K y ERK. Mediante sobreexpresión de CBP (CRE protein binding protein) o p300, se bloqueósignificativamente la represión por TPA o sobreexpresión de Fos/Jun, de la actividad delpromotor de ALAS. Por otra parte, cuando el sitio TRE se ubicó en diferente contexto conrespecto a los sitios CRE, éste se comportó como un enhancer de la transcripción. Proponemos que la disminución en la actividad basal del promotor de ALAS enpresencia del TPA puede reflejar una disminución en la capacidad del promotor de ensamblarun complejo de pre-iniciación eficiente, debido al secuestro de CBP, por parte de AP-1. Asimismo, sugerimos que las propiedades transcripcionales del sitio TRE serian dependientesde la disposición espacial, con respecto a los sitios CRE.

Identificador:

https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3496_Guberman