Mecanismos de acción de la insulina en la represión de la transcripción : el gen de la 5-aminolevulinato sintetasa como modelo experimental

Institución otorgante:

Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Fecha:

2002

Tipo de documento: 

info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
 

Formato:

application/pdf

Idioma:

spa

Descripción:

La insulina desempeña un papel clave en la regulación de múltiples procesos celulares. La unión de la hormona a su receptor en la superficie celular activa la actividad intínsecade quinasa de tirosinas del mismo, ocasionando la autofosforilación del receptor y lafosforilación de sustratos intracelulares denominados IRSs. Los IRSs actúan comomoléculas adaptadoras en la transducción de señales, reclutando a una gran variedad deproteínas que contienen dominios de homología Src (SH2), entre ellas: la subunidadregulatoria (p85) de la PI3K a la “growth factor receptor binding protein 2”(Grb2). Esteevento conduce a la activación de las cascadas de la PI3K y de Ras/MAPK,respectivamente. En el presente trabajo hemos examinado la acción de la hormona peptídica sobre laexpresión del gen de la 5-aminolevulinato sintetasa (ALAS) en hepatocitos de rata y encélulas de hepatoma humano HepG2. La ALAS es la primera enzima y regulatoria de labiosíntesis del hemo, su nivel es normalmente bajo en el hígado pero se incrementamarcadamente en respuesta a drogas porfirinogénicas como el fenobarbital. El tratamientocon insulina 5nM produjo una notable disminución en los niveles del mRNA de ALAStanto en condiciones basales como de estimulación con fenobarbital. Este efecto fue dosisdependiente como pudo observarse mediante ensayos de Northern y slot blot. Por otraparte la vida media del mRNA de ALAS no fue modificada por la presencia de la hormonalo que sugiere que la acción ejercida por la insulina sería relevante a nivel transcripcional. Con la finalidad de determinar la actividad transcripcional del promotor, realizamos unaconstrucción (pACAT) que contiene 876 pb de la región 5’ flanqueante del gen de ALASdirigiendo la expresión de la cloramfenicol acetiltransferasa (CAT). En cotransfeccionestransientes de células HepG2 observamos una significativa disminución de la actividad CAT cuando se incubaron las células con la hormona. Considerando estos resultados, utilizamos dos metodologías diferentes paracaracterizar las vías de transducción de señales involucradas en la represión hormonal de ALAS. En un primer abordaje empleamos agentes químicos, permeables a la membranaplásmatica, que inhiben específicamente a proteínas intermediarias de la señalización deinsulina, para evaluar la contribución de estos efectores a la respuesta final. Losinhibidores de la PI3K (wortmanina y LY294002), de la famesilación de Ras (lovastatina y PD152440) y de MEK (PD98059) abolieron la acción de la insulina, mientras que elinhibidor de mTOR/p70RSK (raparnicina) no tuvo efecto alguno sobre la represiónhormonal. Por otra parte, analizamos el efecto de la sobrexpresión de formas dominantesnegativas o constitutivamente activas de intermediarios de las vías de Ras/MAPK y de la PI3K para evaluar el papel de estas cascadas en la inhibición transcripcional de ALAS. Lacotransfección de células HepG2 con versiones dominantes negativas de SOS, Ras, Raf, MEK y MAPK interfirió la acción de la insulina, mientras que la cotransfección conformas constitutivamente activas de Ras, MEK y p90RSK mimetizó la inhibiciónhormonal per se, independientemente del estímulo en el receptor. Un comportamientosimilar se obtuvo cuando empleamos versiones dominantes negativas de PI3K y PKB o ala PKB miristoilada, respectivamente. Estos resultados nos permiten proponer que laseñalización a través de ambas vías es requerida para obtener la totalidad del efecto final. Por último, la regulación hormonal fue mediada por un fragmento de ll7 pb (-469/354)del gen de ALAS, capaz de conferir sensibilidad a insulina cuando fue subclonado ríoarriba del promotor heterólogo de la quinasa de tímidina (pALIRE). Esta región presenta lasecuencia GTTTTG, muy similar al IRE canónico reportado para genes reprimidos por lainsulina, que resultó crucial para la inhibición. En EMSAs pudo observarse la formaciónde complejos por unión a secuencias con alta homología a las de HNF3 y NF1 presentes enesta región. Todos estos hallazgos sugieren que la insulina requiere la acción orquestada deefectores celulares (intermediarios de las cascadas Ras/MAPK/p90RSK y PI3K/PKB)y de factores de transcripción que reconocen secuencias específicas y abre laposibilidad de considerar que miembros de las familias HNF3 y NF1 podrían interveniren la respuesta.

Identificador:

https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3449_Scassa