Expresión de antígenos del virus de la fiebre aftosa en plantas de alfalfa transgénicas : su utilización como inmunógenos experimentales

Institución otorgante:

Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Fecha:

2001

Tipo de documento: 

info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
 

Formato:

application/pdf

Idioma:

spa

Descripción:

El uso de plantas transgénicas como sistema de expresión de antígenosrelevantes ha sido ampliamente evaluado dada la posibilidad de utilizar plantasmodificadas genéticamente para la producción de vacunas. Las vacunas a base de plantas serían más baratas y más fáciles de elaborar engrandes cantidades. Estas vacunas se podrían producir en países en desarrollo sinnecesidad de instalaciones sofisticadas y costosas como las que se necesitan en laactualidad. Por otra parte, estas vacunas eliminarlanel riesgo de virus contaminantes queexiste en las vacunas producidas en líneas celulares de mamíferos ya que los posiblesvian de plantas contaminantes no constituyen un peligro potencial ni para el hombre nipara los animales. Adicionalmente, las plantas transgénicas que expresen antígenos ensus tejidos comestibles podrían ser usadas como sistemas de producciónde vacunas deadministración oral. Hasta el momento, la mayoría de los antígenos expresados consisten en péptidos,proteínas únicas ó estructuras muy simples. Sin embargo, la producción de antígenosvacunales en sistemas heterólogos requiere, en muchos casos. ía expresión deestructuras antigénicas complejas. EIVirus de la Fiebre Aftosa (VFA)produce una de las enfermedades más temidasdel ganado debido a su amplia distribucióngeográfica y por ser altamente contagiosa. La vacuna utilizada actualmente es polivalente y a virus inactivado. El progreso enla producción de vacunas antiaftosas está dirigido hacia el logro de vacunas deelaboración más fácily económica y que eviten la manipulación de grandes cantidades devirus. Una alternativa a las vacunas convencionales es la preparación de cápsidesvacías expresando y procesando la poliproteína precursora en un sistema de expresiónheterólogo. Se han obtenido cápsides vacías confonnacionalmente correctas de losserotipos A, 0 y C del VFA utilizando sistemas de expresion en E. CoIi, baculovirus o virus vaccinia. Los resultados obtenidos hasta ahora al expresar cápsides vacías del VFA ensistemas heterólogos, con relación a Ia conservación de epitopes protectivos, lasconvierten en antígenos candidatos para la formulaciónde vacunas. Sin embargo, aún nose ha logrado un método de expresión masiva de un inmunógeno eficaz como para serutilizado a campo, ya que los sistemas desarrollados hasta ahora resultan costosos ypoco aplicables a nivel industrial. Como primer objetivo de este trabajo de tesis se propuso producir plantas dealfalfa transgénicas conteniendo el gen que codifica para la poliproteína P1 precursora delas proteínas estructurales del VFA. Las construcciones utilizadas involucran únicamentea P1 ó a P1 junto con la proteasa SC. La presencia del gen foráneo se detectó, en lasplantas transgénicas, por PCR y su actividad transcripcional específica por RT-PCR y Northern blot. Fue posible visualizar por microscopía electrónica estructuras que por sutamaño y morfología podrían corresponder a cápsides vacías del VFA. Lainmunogenicidad de los productos expresados fue evaluada en el modelo murino. Ratones adultos inmunizados intraperitonealmente desarrollaron una respuesta deanticuerpos detectada por su reactividad. en ELISA, frente a un péptido sintetico querepresenta la zona más inmunogénica de VP1 y partículas virales completas; y, en Western blot, frente a las proteínas estructurales del virus nativo. Además, estos animalesdesarrollaron anticuerpos neutralizantes y resultaron completamente protegidos frente aldesafío con virus infeccioso. Estos resultados demuestran la factibilidad de expresarantígenos altamente complejos en plantas transgénicas y su utilizacióncomo efectivosinmunógenos experimentales. Los resultados obtenidos por nuestro y otros grupos de investigación demuestranla factibilidad de la utilización de plantas transgénicas como fuente de producción deantígenos vacunales. Sin embargo, uno de los principales problemas que posee estesistema de expresión es que los niveles de proteína expresada en las plantastransgénicas son relativamente escasos como para extrapolar su uso a una vacuna deaplicabilidad real. De modo que, el desarrollo de estrategias que generen una mayor concentraciónde la proteína recombinante es sumamente importante, especialmente cuando se deseautilizar los extractos de planta sin ningún proceso de enriquecimiento y/o purificaciónposterior. Dado que la inserción del transgen en el genoma vegetal es al azar, esaltamente probable que los niveles de su expresión varíen entre los individuos producidos. Una alternativa posible, entonces, consiste en poder identificar aquellos individuos quepresentan niveles excepcionalmente altos de la proteina foránea. Sin embargo, laidentificación de aquellas plantas que expresen cantidades significativas de antígeno pormétodos inmunológicos es un proceso lento y labioroso. Teniendo en cuenta lo mencionado anteriormente, y como segunda parte de estetrabajo de tesis, hemos desarrollado una metodologia que nos permite evaluar un grannúmero de individuos y seleccionar de un modo fácil y rápido aquéllos que presentanmayores niveles de expresión de la proteina recombinante. Esta metodologia se basa enla expresión de un gen de interés fusionado a un gen reportero, codificante para la enzima B-Glucuronidasa (B-GUS), cuya presencia puede ser detectada cuantitativamente porcolorimetrla. A fin de evaluar el sistema de selección propuesto, utilizamos como antígenoun péptido que comprende los residuos 135 a 160 de la proteina VP1 del VFA paragenerar la proteina de fusión con la enzima B-GUS.Las plantas transgénicas obtenidasfueron primeramente evaluadas por su actividad enzimática de B-GUS. Fue posibledetectar por Western blot la proteina de fusión en aquellas plantas que presentaronmayores niveles de B-GUS. Las plantas seleccionadas expresaron 0.5-1 pglmg deproteina soluble total. El péptido p135-160 expresado como proteina de fusión conservósus caracteristicas inmunogénicas ya que ratones inmunizados parenteralmente con unavacuna elaborada con extracto foliar desarrollaron una respuesta de anticuerposespecificos detectada por su reactividad en ELISAfrente a p135-160, particulas viralescompletas y en Western blot frente a VP1. Además, se detectaron anticuerposneutralizantes que resultaron protectores frente al desafio con virus infeccioso. Estos resultados demuestran la posibilidad de utilizaruna metodologia simple paradetectar las plantas que expresan altos niveles del péptido recombinante, el cual conservasus propiedades antigénicas e inmunogénicas al ser expresado como proteina de fusión.

Identificador:

https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3402_DusSantos