Purificación, caracterización, clonado y expresión de malato dehidrogenasas del helminto parásito Echinococcus granulosus

Institución otorgante:

Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Fecha:

2001

Tipo de documento: 

info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
 

Formato:

application/pdf

Idioma:

spa

Temas:

ECHINOCOCCUS GRANULOSUS - MALATO DEHIDROGENASA - MDH - METABOLISMO INTERMEDIARIO - ECHINOCOCCUS GRANULOSUS - MALATE DEHYDROGENASE - MDH - INTERMEDIARY METABOLISM

Descripción:

Las isoformas de malato dehidrogenasa presentes en protoescólices de E. granalosus fueron purificadas ahomogeneidad, mediante un protocolo que incluye un fraccionamiento con sulfato de amonio y la separación delas isoformas citosólica y mitocondrial mediante cromatografía de afinidad en 5'-AMP-Sefarosa. La mMDH es llevadaa homogeneidad mediante la adición de una cromatografía de afinidad en Blue Sepharose. La cMDH en cambio espurificada siguiendo un protocolo ya descripto que incluye cromatografía de intercambio iónico en DEAE-celulosa,filtración molecular en columna de Superosa 12 y cromatografía de afinidad en Blue Sepharose.la identidad de las isoformas fue confirmada mediante i) el estudio del comportamiento cinético de ambas enpresencia de exceso del sustrato oxaloacetato, ii) el comportamiento diferencial que muestran las dos isoformasfrente al detergente catiónico CTAB y iii) la secuenciación de péptidos a partir de ambas. En el caso de la mMDH, cuyo gen no se encontraba clonado, la información peptídica obtenida permitió comenzarel clonado del mismo, por amplificación de dos fragmentos del ADNc codificante de la enzima. Con ellos, se rastreóuna biblioteca de ADNc de protoescólices que permitió extender la secuencia del ADNc hacia el extremo 3'. Finalmente, la secuencia del ADNc se completó utilizando la técnica de amplificación rápida de extremos de ADNc (5' RACE), que permitió amplificar y secuencia: el extremo 5’ faltante. El ADNc completo fue utilizado para expresar,en forma recombinante, a la mMDH, en forma de fusión con la glutation-S-transferasa de S. japonicum. La proteínarecombinante resultó activa y los parámetros cinéticos de la misma fueron comparados con los obtenidos para laenzima obtenida de la fuente natural. La cMDH recombinante, clonada y expresada por el grupo del Dr. Arnaldo Zaha también fue comparadacinéticamente con la enzima natural purificada en esta Tesis.

Identificador:

https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3350_Aguero