Mecanismos de señalización inducidos por el factor de crecimiento y transformación Beta 1 (TGF beta sub 1), en fibroblastos de ratón Swiss 3T3

Institución otorgante:

Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Fecha:

2000

Tipo de documento: 

info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
 

Formato:

application/pdf

Idioma:

spa

Temas:

TGF BETA1 - PKC - TPA - CICLO CELULAR - MECANISMOS DE SEÑALIZACION - PGF2ALFA - SWISS 3T3 - TGFBETA1 - PKC - TPA - CELL CYCLE - SIGNALLING MECHANISMS - PGF2ALFA - SWISS 3T

Descripción:

La superfamilia del TGFβ está formada por polipéptidos que regulan diferencialmente ladivisión celular, en mamíferos. Dependiendo del tipo celular, el TGFβ1 puede inhibir, promover opotenciar la división celular. En monocapas confluentes y aquietadas de la línea celular Swiss 3T3, el TGFβ1 (O,5—2 ng/ml) no induce, ni inhibe la proliferación celular. Sin embargo, estefactor es capaz de potenciar la proliferación inducida por la PGF2α (300 ng/ml) [Gómez de Alzagaet aL., 1994]. De las señales activadas por la PGF2α, se buscó cúales eran las más importantes en lasinergia con el TGFβ1. Se comenzó estudiando la quinasa C (PKC), a través de la retromodulacióncon 12-tetradecanoilforbol l3-acetato (TPA, 800 nM, 96 hs.), o Briostatina l (lOOnM, 96 hs.). En la condición de retro-modulación de la PKC, se observó que el TGFβ1 (1,0ng/ml) era capaz de inducir la proliferación celular (50 % de células en fase S, después de 28 hs.de estimulación, y 50 % de aumento en el número de células, después de 48 hs. de estimulación),siendo ésta dependiente, tanto de la concentración del factor, como de la concentración de loscompuestos que retro-modulan la PKC. En las células pretratadas con TPA, la fase G1 tiene unas 6 a 7 horas más, que en las células sin pretratar. En la primer condición, el TGFβ1 induce laexpresión de la ciclina D1, y en correlación a la mayor duración de la fase G1, ocurre horas mástarde después de la estimulación (lO-12 hs.), comparado con las células sin pretratar, estimuladascon PGF2α (6-9 hs.) [Sauane et al., 2000]. Fue interesante observar, que la PGF2α, induce laexpresión de la ciclina Dl, en células pretratadas con TPA, aún cuando en esta condición no esmitogénica, y a pesar que la CDK4 se halle presente. Este resultado lleva a plantear que laexpresión de la ciclina Dl, no necesariamente indica que la célula se dividirá, y además que esindependiente de la PKC. Con el uso del anticuerpo monoclonal anti PKCα [Leach et al., 1988], seobservó que esta enzima está ausente en el momento de agregado el TGFβ1, en célulaspretratadas con TPA. La inhibición directa de la PKC con el inhibidor específico GF 109203X (1O μM), agregado una hora antes a células sin pretratar, no fue suficiente para permitir que el TGFβ1 indujera la mitogénesis. El GF es capaz de inhibir parcialmente la sinergia entre el TGFβ1y la PGF2α, mientras que inhibe totalmente la sinergia entre el TGFβ1 y el OAG, en células sinpretratar. Es decir que la PKC no es suficiente, pero sí necesaria en la primer sinergia, y sí muyimportante en la última. El agregado de GF por períodos prolongados, no logra retro-modular la PKC. Los receptores del TGFβ1, detectados con el uso de anticuerpos, están presentes en ambascondiciones, y la medición del transporte de glucosa, inducido por este factor, pone en evidenciaque la actividad de los mismos, no se ve alterada por el pretratamiento con TPA. El agregado deácido okadaico (5 nM), junto al TGFβ1, en células sin pretratar, induce la síntesis de ADN (lO %de células en fase S), indicando la presencia de fosfatasas de ser/thr, pero no sería el únicoimpedimento, por el cual el TGFβ1 no es mitogénico en las células Swiss 3T3. En el estudio delas sinergias del TGFβ1 con insulina y PGE1, se observó que, en células pretratadas con TPA, PGE1 no induce la proliferación, ni potencia la inducción de esta última por el TGFβ1 solo oagregado con insulina. De estos resultados se concluye, que la PKC es necesaria para que la PGE1 potencie la sinergia entre el TGFβ1 más insulina. La falta de potenciación entre el TGFβ1 yla PGE1, podría indicar un camino de señalización en común. Inhibiendo la PKA con PKI,péptido inhibidor (l nM), y también con el uso del inhibidor H-89 (l nM), se encontró que lainhibición de esta enzima no altera la inducción de la proliferación por el TGFβ1, en célulaspretratadas con TPA. Con el uso del inhibidor genisteina (10 μM), se observó que las quinasas detirosina están involucradas en la sinergia del TGFβ1 y la PGF2α, en ambas condiciones, y en lainducción de la proliferación por el TGFβ1, en células pretratadas con TPA. El uso de lovastatina (80 μM) y mevalonato (800 μM), puso en evidencia la importancia relativa de la isoprenilaciónde proteínas, en la sinergia entre el TGFβ1 y la PGF2α, en ambas condiciones. El TGFβ1 no activala MAPK (ERK 1/2) en ninguna condición, ni potencia la actividad, ni la presencia de la misma,en la sinergia con la PGF2α. La actividad de esta enzima se midió, a través de lainmunoprecipitación y fosforilación de la mielina básica, y con el anticuerpo anti ERK 1/2,bifosforilado (forma activa). El TGFβ1 induce la translocación de la Smad4 (medida porinmunoflourescencia, con anticuerpo anti Smad4), en ambas condiciones, y ésta no se ve alteradaen las sinergias de este factor y la PGF2α. En conclusión, el TGFβ1 induce la proliferación celularen células Swiss 3T3, que han sido pretratadas con compuestos capaces de retro-modular la PKC,es decir, primero activada y luego degradada. La inducción de la ciclina Dl, debe ocurrir por unavía alternativa a ERK l y 2. El pretratamiento con TPA lleva a las células a una fase G0 diferentede la misma fase en la que se encuentran las células confluentes y aquietadas, sin pretratar. El TGFβ1 activa las moléculas señalizantes específicas de su camino de señalización, y éstas debeninteraccionar con factores de transcripción u otros compuestos, que surgen por el pretratamientocon TPA, haciendo que la fase G1 sea más larga, tiempo en el cual se sintetizan y/o modificancompuestos necesarios para inducir la proliferación celular.

Identificador:

https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3296_Cadenas