Estudios sobre la porfobiblinógeno-deaminasa de hígado y riñón de rata

Institución otorgante:

Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Fecha:

1998

Tipo de documento: 

info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
 

Formato:

application/pdf

Idioma:

spa

Temas:

PORFOBILINOGENO-DEAMINASA - PORFIRINAS - CONSTANTES CINETICAS - HIGADO - RIÑON

Descripción:

La porfobilinógeno-deaminasa (PBG-D) cataliza la condensación de cuatro moléculas deporfobilinógeno (PBG) para formar el hidroximetilbilano, el cual en presencia de la enzimaisomerasa, origina el uroporfirinógeno m, precursor fisiológico en la síntesis de hemos, clorofilasy corrinas. Dado que bajo ciertas condiciones, la PBG-D podría actuar como segundo sitio deregulación, se resolvió estudiar la PBG-D de hígado y de riñón de rata, con un enfoque cinético. Se purificaron ambas enzimas empleando las siguientes técnicas: fraccionamiento con sulfato deamonio, filtración molecular (Sephadex G-lOO), intercambio aniónico (Q-Sepharosa) ycromatografla de afinidad (Blue Sepharosa). La purificación a homogeneidad de la enzima renal selogró mediante una electroforesis preparativa, que mostró una sola banda proteica con actividad,confirmada a través de Western blots. La actividad máxima se detectó en incubaciones a 65°C, apH’s 7,8 y 8,2 con una energía de activación calculada de 16,8 kcal/mol y 19,3 kcal/mol y sedetemiinaron las masas moleculares relativas: 41,7 ± 4,2 kDa y 39,8 ± 4,0 kDa para las enzimashepática y renal respectivamente. La PBG-D de hígado de rata presenta un comportamiento michaeliano, con valores aparentes de Kmy Vm de 12 ± 1,4 μM y 17,0 ± l,4 pmoles/mg.min. respectivamente y un n de Hill de 1,determinados a pH 8,2 y a 37°C. Estudios cinéticos revelaron que los iones Mg2+ (0-80 mM) yfosfato (0-20 mM) actúan como inhibidores incompetitivos, mientras que el amonio (0-50 mM) y lasulfarnerazina (0-2,0 mM) son inhidores no competitivos. En cambio, el ácido fólico (0-2,0 mM)actúa como un activador no esencial de la reacción. Para la enzima renal, los estudios cinéticos mostraron un comportamiento complejo, con unaprimera zona de saturación comprendida entre 5,0 y 7,0 μM y una segunda a partir de 66-70 μM. Los gráficos de dobles recíprocas son no lineales y exhiben un carácter bimodal que se traduce endos constantes aparentes de afinidad, Km1: 0,8 ± 0,1 μM y Km2: 3,5 ± 0,4 μM. Comparando estasconstantes cinéticas con las correspondientes para médula (Km: 0,8 ± 0,1 μM y Km2: 3,3 ± 0,4 μM)y corteza renal (Km: 0,9 ± 0,1 μM y Km2: 5,1 ± 0,6 μM), se sugiere que no existirian dospoblaciones proteicas distintas confinadas en diferentes estructuras. Además, la banda únicaobtenida (pI: 4,9) mediante la técnica de isoelectroenfoque, permitió descartar la presencia deisofonnas en riñón. Estudios cinéticos revelaron que el ion sodio (0-2,0 M) produjo undesplazamiento del punto de inflexión hasta obtener gráficos de inversas con una sola pendiente. Aaltas concentraciones de sustrato (7-66 uM) los iones Mg2+ (0-50 mM), fosfato (0-40 mM) yamonio (0-300 mM) actúan como inhibidores no competitivos. A bajas concentraciones de sustrato (0,8-7,0 pM) el Mg2+ es un inhibidor incompetitivo, el fosfato presenta un efecto dual y el amoniodesplaza el punto de inflexión conforme aumenta su concentración. Estudios de inhibiciónrealizados con PCMB, NEMI y DTNB demostraron la presencia de aminoácidos cisteína en el sitioactivo, lo cual fue confirmado a través de estudios de grupos ionizables en la enzima y en loscomplejos enzima-sustrato. Se propone para la enzima renal, la existencia de por lo menos dosestados confonnacionales diferentes inducidos en el mismo sitio catalítico, ya sea por la unión delsustrato PBG o la no liberación del producto amonio o de ambos. La presencia de tales cambiosconfonnacionales permitiría la continuidad en la unión de las otras moléculas de PBG al sitio S, enpresencia de intermediarios ES1, ES2 o ES3 en el sitio C, lo que originaria una diferente afinidad yactividad catalítr'ca final. Estos reordenamientos podrian producir finalmente cambios en los pasoslimitantes de la reacción, lo cual sucedería a diferentes concentraciones de sustrato y daría lugarentonces a distintas constantes cinéticas.

Identificador:

https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3022_Noriega