Estudio de la organización genómica de elementos de ADN de Taxoplasma gondii y su aplicación al diagnóstico directo de la toxoplasmosis humana

Institución otorgante:

Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Fecha:

1997

Tipo de documento: 

info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
 

Formato:

application/pdf

Idioma:

spa

Descripción:

Toxoplasma gondii es uno de los parásitos protozoarios más ampliamentedistribuidos a nivel mundial, y usualmente causa una enfermedad asintomática enlos humanos. Sin embargo, la reactivación de la infección crónica en pacientesinmunocomprometidos, y la toxoplasmosis congénita de una infección primariaadquirida durante el embarazo, presentan cuadros clínicos muy severos e inclusopuede causar la muerte del paciente. Además, debido a que T. gondii causamortalidad de los neonatos en ovejas, también representa una causa importante depérdida económica en las granjas. En este trabajo dos familias de ADN repetitivas de T. gondii fueroncaracterizadas. ABGTg7 (721 bp) presenta dos monómeros repetidos completos y 55 nt de un tercero, mostrando una disposición de tandems directos cuya unidadrepetida es de aproximadamente 340 bp. ABGTg8 (1002 bp) contiene dos elementosrepetidos distintos: uno denominado ABGTg8.2 y un elemento ABGTg7. ABGTg7y ABGTg8.2 muestran patrones de hibridación muy similares en Southern-blots de ADN de T. gondii digerido con distintas endonucleasas de restricción, sugiriendoque ambos elementos principalmente se encuentran en la misma estructurarepetitiva en tandem en el genoma. Análisis de PFGE mostraron que estos elementosrepetidos se encuentran en al menos tres de los 4 cromosomas más grandes de T.gondii. Ensayos de sensibilidad a la endonucleasa Bal 31 indicaron que seencuentran localizados cerca de los telómeros de los cromosomas así como tambiénen otras regiones de los mismos. Cinco fagos lambda recombinantes genómicosfueron aislados y dos clusters diferentes completos de la estructura repetitiva fueronanalizados. Ambos clusters contienen uno de sus extremos conservados con unfragmento de 4.4 Kbp donde se halla ubicado ABGTg8.2, ligado a numerososfragmentos Sal I conteniendo todos al menos una copia de los monómeros de ABGTg7. Dentro de estos clusters ambos elementos repetidos forman parte de unaestructura compleja en tandem, donde los monómeros de ABGTg7 se encuentrandispuestos tanto como tandems directos como flanqueados por otros elementosrepetitivos sin o con baja homología entre ellos. Esta estructura repetitiva en tandemcumple los requerimientos asignados al ADN satelital. Por otra parte, se evaluó el uso potencial de la secuencia ABGTg7 para eldiagnóstico de la toxoplasmosis humana. Se realizaron ensayos de hibridaciónmediante la técnica de Dot-blot en muestras de sangre de pacientes contoxoplasmosis cerebral (CT), linfoadenopatía toxoplásmica (ATL) y toxoplasmosisdiseminada en pacientes trasplantados (TR). Se estudió un total de 84 individuos. Seencontraron señales positivas por Dot-blot en 12 (66.7%) de 18 casos con CTconfirmada, 9 (52.9%) de 17 casos con ATL y 2 (66.7%) de 3 casos con TR contoxoplasmosis. En paralelo se realizaron ensayos de PCR en los pacientes con ATL,resultando en la detección de ADN de T. gondii en 10 casos (58.8%). Un estudiocomparativo entre el Dot-blot y la PCR fue realizado también en ratonesexperimentalmente infectados con taquizoitos, el cual arrojó resultados similares: 60% y 70% de valores positivos respectivamente. Finalmente la suma de valorespositivos obtenidos con ambos tests (Dot-blot más PCR) incrementó el número desospechas de infección toxoplásmica en los pacientes con ATL a un 76.4% de casos. Por otro lado, si se consideran los resultados positivos obtenidos simultáneamentepor las dos técnicas, se confirmó el resultado en el 35.2% de los casos. Estosresultados indican que la sonda repetitiva ABGTg7 es un recurso adicional útil parael diagnóstico de la toxoplasmosis humana. Finalmente, teniendo en cuenta los resultados obtenidos en los estudiosbásicos sobre la organización genómica de estos elementos repetidos, se desarrollóun ensayo de PCR basado en la secuencia ABGTg7 con el objeto de ser evaluadocomo herramienta diagnóstica.

Identificador:

https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n2982_Matrajt