Estudio del plasma seminal humano y de sus glicoproteínas antigénicas

Institución otorgante:

Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Fecha:

1986

Tipo de documento: 

info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
 

Formato:

application/pdf

Idioma:

spa

Descripción:

Este trabajo de Tesis tuvo por objeto e] estudio delplasma seminal humano y sus glicoproteínas antigénicas. Enél se presentan: 1.- Una introducción donde se discuten las investigacionesrealizadas hasta ese momentoen el P.S.H. Estos antecedentesson fundamentalmente de tipo clínico e inmunológico, y reciéna partir de 1974 comenzaron a aparecer unos pocos estudios detipo químico. Estos trabajos estuvieron destinados principalmentea la evaluación de la fertilidad masculina y no a labúsqueda del origen de los problemas de infertilidad. 2.- Dada la complejidad del P.S.H. y la diversidad de suscomponentes, se incluye una descripción del órgano que losproduce, el aparato reproductor masculino, no sólo en su aspectomorfológico sino también fisiológico. 3.- Los estudios realizados sobre los componentes macromoleculares y de bajo peso molecular del P.S.H.. En el primer casose trató, asimismo, de ejemplificar con algunos casos de deficienciasorgánicas y, a partir de los estudios llevados acabo con dadores sanos y fértiles, se postuló la necesidad deque en el futuro se proceda también a investigar los eyaculadoshumanos provenientes de distintos casos patológicos. 4.- Para una mejor comprensión del tema de investigación y enrazón de tratarse de un tema relativamente reciente, poco desarrollado,que requiere el uso de numerosos conocimientosteóricos, se procedió a 1a revisión de los mismos. Esta revisiónse efectuó dentro del margen mínimo compatible con dichacomprensión y sólo se incluyeron los aspectos considerados indispensables. Este resumen teórico abarca: a.- Una descripción sobre las glicoproteínas y su importantepapel biológico: la inducción de la conformación proteica,la protección de la proteína contra el ataque proteolítico,el control de la permeabilidad de membrana, y su función como señal de reconocimiento. Se presenta también un estudiosobre la estructura primaria de n-glicanos e isoglicanos, ladeterminación de la estructura por espectroscopía de r.m.n.-¹H,y la conformación espacial de los glicanos. b.- Un estudio de las uniones hidratos de carbono-proteínamás importantes, haciendo énfasis en las O-glicosídicas dadoque son las usualmente encontradas en secreciones como el P.S.H. Se indican asimismo, los tipos de ruptura, los métodosde determinación de aminoácidos olefínicos y los efectos dela degradación alcalina sobre las cadenas de hidratos de carbono. c.- Se presenta con cierto detalle un análisis sobre las distintaslectinas empleadas en este trabajo, ya que el estudiode estos compuestos ha demostrado en los últimos años su extraordinaria importancia, por ejemplo, en la investigación sobrela naturaleza y estructura de las cadenas de hidratos de carbono. d.- Se discuten las ventajas de la cromatografía de afinidad sobrelos métodos cromatográficos convencionales para el aislamientoy purificación de las glicoproteínas, y las característicasde la lectina empleada en este caso, la Con A inmovilizada sobre Sepharosa 4B. e.- Se analiza la posibilidad que ofrece la cromatografía deinteracción hidrofóbica una separar los componentes del P.S.H.en base a las diferentes fuerzas de interacción hidrofóbicaentre éstos y los grupos hidrofóbicos de la fase no cargada (Octyl-Sepharosa). 6.- Las características del estudio realizado y la gran variedad de datos obtenido determinaron que, para lograr una mayorclaridad en la descripción y discusión de los resultados, sehiciera necesario separar la presentación de los estudios delplasma seminal entero del de las fracciones glicoproteicas obtenidasa partir del mismo. El resumen de dichos estudios seindica a continuación: I.- Plasma seminal humano. La composición en monosacáridos del P.S.H.D. presentó las características propias de las glicoproteínasde tipo O-glicosídico, es decir, N-acetiigaiactosamina,galactosa, fucosa y ácido N-acetilneuramínico, y también seencontraron monosacáridos de glicoproteinas N-glicosídicas,como manosa y N-acetilglucosamina. Esto nos llevó a suponerque el P.S.H. podia estar constituído por glicoproteínas deambos tipos (mucinas y séricas). Por otra parte, los aminoácidosdeterminados en el P.S.H.D. no eran ni los de las mucinas nilos de las glicoproteínas de tipo sérico; para interpretar estehecho se tuvo en cuenta que el P.S.H. contiene fluido prostáticoque es rico en proteasas que hidrolizan los componentesprotéicos del mismo, siendo un fenómeno visible de esta proteólisisla licuefacción del coágulo luego de la eyaculación. Se demostró también la presencia de lipoproteínas en el P.S.H.D. La inmunodifusiones contra antisuero de conejo (A.P.S.H.D.)presentaron una distribución compleja de, por los menos, seisbandas definidas y un fondo difuso. La alta velocidad de difusión indicó un bajo peso molecular para los antígenos. En lainmunoelectroforesis contra A.P.S.H.D. no se observó la presencia de albúmina ni de los componentes de mayor movilidad catiónica o aniónica. Aparecen, por lo menos, siete líneas de precipitación; la posición de los arcos, un poco deformados, indicóla heterogeneidad carga/masa de los antígenos y la similitudde las propiedades de difusión. Los resultados de la ultracentrifugación del P.S.H.D.en un medio de alta fuerza iónica y en un medio altamente disociante, mostraron la formación de un único pico, y en amboscasos se observó una polidispersión del peso molecular. Laobtención de un pico más agudo y simétrico en el medio conteniendodetergente, indicó una distribución más estrecha delpeso molecular. Los diagramas de elución de 1as cromatografíassobre Sephadex G-100 indicaron una complejidad crecienteal incrementar la fuerza iónica del medio, aunque la distribución total no varió demasiado, observación que no se repitióal cromatografiar en un medio con detergente donde el diagramade elución resultó más compiejo, con la aparición de nuevospicos; la adición de una sal caotrópica a dicho medio redujola complejidad. Al cromatografiar sobre Sephadex G-15, los diagramas más complejos se obtuvieron nuevamente en medio con detergente. La cromatografía sobre Octyl-Sepharosa reveló la diferentehidrofobicidad de los componentes del P.S.H.D. En 1aelectroforesis sobre gel de poliacrilamida se encontró unadistribución nuevamente compleja de los componentes, con variasbandas, bien definidas, y pesos moieculares aparentes comprendidosentre 1os 10.000 y 93.000 da1tons. Al disminuir la concentración de la muestra se observaron solamente dos bandas,gruesas, y otras más débilmente coloreadas y sus pesos moleculares fueron de 10.000 a 16.000 daltons. Los estudios de las estructuras de los oligosacáridosdel P.S.H.D. por reacción con lectinas mostraron que estoscomponentes dan reacciones positivas con todas las lectinasseleccionadas para este trabajo, tanto antes como después deltratamiento con neuraminidasa. Este estudio permitió determinarlos extremos terminales no reductores de las cadenas de oligosacáridos,asi como algunas de las unidades subterminales alos mismos. La determinación de los aglutinógenos indicó queel P.S.H.D. presenta actividad de grupos sanguíneos A, B y 0,lo que demostró la presencia de los correspondientes determinantesantigénicos. II.- Fracciones glicoproteicas del P.S.H.D. El estudio de lascromatografías de afinidad del P.S.H.D. sobre Con A-Sepharosapermitió deducir que las glicoproteínas eluídas con el bufferde fosfato a volúmenes de elución correspondientes a losmarcadores no interactuantes, no contenían grupos terminalesno reductores o de interior de cadena con la configuraciónadecuada para interaccionar con la lectina. Dado que estoscomponentes no eran eluídos en un solo pico, se sugirió quela separación se debia a interacciones débiles entre éstosy la Con A-Sepharosa. La posterior elución con buffer de boratoseguida de buffer de fosfato conteniendo α-D-metil-giucósidohizo posible la elución de materiales que interaccionaban conla lectina. Fue posible asimismo correlacionar el efecto de la variaciónen la concentración del buffer de borato con los cambios de temperatura de ios sistemas cromatográficos, y deducir que eltener en cuenta solamente la especificidad de la lectina nobastaba para explicar el fraccionamiento cromatográfico sobre Con A-Sepharosa del P.S.H.D. La purificación de las fracciones se llevó a cabo porcromatografía sobre Sephadex G-15 y por ultrafiltración. Severificó que un alto porcentaje de los componentes de las fragciones (no en F1) difunden en la malla del gel G-15 y, por lotanto, se pudo afirmar que la parte proteica debe estar presente en forma de péptidos de bajo peso molecular, que provienende la proteólisis del P.S.H.D. Este hecho está de acuerdo conla idea de la formación de agregados moleculares por la afinidad de unión que presentan estos péptidos en las mucinas. El análisis de los hidratos de carbono mostró que lasdistintas fracciones presentan cantidades variabies de losmismos. Así, entre las F, la F1 posee un 44,5% mientras que la F2 sólo un 3,2%, lo cual explicaría, al menos en parte, elcomportamiento diferencial en la cromatografía de afinidad. Si bien la F2 contiene un 24,2% de manosa, no se une a la Con A-Sepharosa, aunque sí reacciona con a Con A soluble. Esto llevó a suponer que la manosa se encuemra en este componenteen forma de residuos internos de cadena y que, por impedimentos estéricos debidos a la inmovilización de la Con A en la Sepharosa, presenta un comportamiento diferente en la cromatografía. La fracción B1 también contiene manosa (2,1%) perono reacciona con la Con A y por lo tanto Consulte el resumen completo en el documento.

Identificador:

https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n1970_Tortorella