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Institución otorgante:
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Tipo de documento: 
Tesis Doctoral
 
Formato:
text; pdf
Idioma:
Español
Descripción:
Los receptores acoplados a proteína G (GPCRs) son los mediadores de las respuestas celulares a una gran cantidad de estímulos, así como también el blanco de muchas drogas terapéuticas. El rol clásico de los GPCRs es acoplar la unión de ligandos a la activación de proteínas G heterotriméricas, que a su vez regulan a múltiples proteínas efectoras. Recientemente se ha demostrado que los modos de señalización de los GPCR son mucho más complejos, involucrando también mecanismos independientes de proteínas G y señalización dependiente de la internalización del receptor. La hormona liberadora de corticotropina (CRH) ejerce un rol clave en la respuesta integrada al estrés. Además de regular la activación del eje hipotálamo-pituitario-adrenal (HPA), CRH está ampliamente distribuida en el sistema nervioso central, donde funciona como un neuromodulador, integrando aspectos comportamentales y afectivos de la respuesta a estrés. Se ha demostrado que la desregulación de la acción de CRH a través de su receptor de alta afinidad, CRHR1, se encuentra involucrada en el desarrollo de estadios patológicos asociados al estrés como ansiedad y depresión. CRHR1 es un GPCR de clase B, que al activarse principalmente se acopla a proteína Gs y lleva a un aumento del segundo mensajero AMP cíclico (cAMP) y la activación de múltiples vías de señalización. Es de particular interés la fosforilación de la MAPK ERK1/2, que induce la transcripción de Pomc para activar el eje HPA en corticotrofos, y se dispara en estructuras del cerebro asociadas a aspectos comportamentales de la respuesta a estrés frente a la estimulación con CRH. Habíamos descripto previamente que CRHR1 activa mecanismos de señalización dependientes de proteína G y otros dependientes de la endocitosis del receptor. Estos dos componentes de respuesta pueden evidenciarse como dos fases diferentes de activación de ERK1/2 en la línea celular hipocampal murina HT22 transfectada establemente con CRHR1 (HT22-CRHR1). En este trabajo, nos focalizamos en la respuesta de cAMP mediada por CRHR1, utilizando métodos clásicos de biología molecular en combinación con biosensores basados en la transferencia de energía resonante de Förster (FRET) para estudiar por visualización dinámica de célula única los mecanismos de señalización de CRH. En primer lugar demostramos que al estimular CRHR1, el aumento en los niveles de cAMP no sólo está mediado por las adenilil ciclasas transmembrana (tmACs) sino también por una adenilil ciclasa soluble (sAC) en las células HT22-CRHR1. sAC es una fuente atípica de cAMP ya que es insensible a proteína G y es regulada por calcio y bicarbonato. Además, se ha reportado que sAC está presente en distintas localizaciones subcelulares, formando microdominios de señalización. La respuesta de cAMP a CRH también se encontró mediada tanto por tmAC como por sAC en la línea celular derivada de corticotrofos AtT20, pero no así en las células 3T3L1-CRHR1. Sin embargo, observamos que tanto en células HT22-CRHR1 como en AtT20, sAC no participa en la señalización de otros ligandos de GPCRs, como isoproterenol o PACAP38, respectivamente. Estos resultados indican que el rol de sAC en la transducción de señales de un GPCR depende del contexto celular y del receptor involucrado. La estimulación con CRH genera un aumento en los niveles de calcio intracelular, y al bloquear la respuesta de calcio se observó un patrón de cAMP y ERK1/2 en respuesta a CRH similar al que se obtiene al bloquear sAC. Esto sugiere que calcio es el activador de sAC río abajo de CRHR1. Luego, nos propusimos caracterizar si ambas fuentes de cAMP contribuyen a un pool común de cAMP o si pueden identificarse roles particulares para cada adenilil ciclasa en la respuesta. Observamos que tanto tmACs como sAC participan en la fase aguda de activación de ERK1/2, pero que en la fase sostenida de fosfo-ERK1/2, dependiente de la internalización de CRHR1, sólo sAC está involucrada. Más aún, demostramos que el CRHR1 continúa generando cAMP desde estaciones endocíticas, y que es sAC la responsable de esta producción una vez internalizado CRHR1. En conclusión, a través de la caracterización de los mecanismos moleculares activados por CRHR1, se hallaron nuevas evidencias que refuerzan el modelo emergente de señalización por GPCR en el que la respuesta de cAMP no ocurre exclusivamente a nivel de la membrana plasmática y donde sAC representa una fuente alternativa de cAMP regulada por GPCRs.
Identificador único:
http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/h/18267
Derechos:
info:eu-repo/semantics/openAccess
http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.5/ar/
Licencia de uso:
Licencia Creative Commons

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Cita bibliográfica:

Inda, María Carolina       Caracterización de distintas fuentes de cAMP en la señalización del GPCR CRHR1.  (Tesis Doctoral).    Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.    [consultado:  ] Disponible en el Repositorio Digital Institucional de la Universidad de Buenos Aires: