untitled

Estudio de la regulación de la expresión y de la relevancia de la metiltransferasa PRMT8 en células madre pluripotentes


Regulation of the expression and relevance of the arginine methyltransferase Prmt8

Luzzani, Carlos Daniel

Director(a):
Guberman, Alejandra Sonia
 
Institución otorgante:
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Fecha:
2013-03-26
Tipo de documento: 
Tesis Doctoral
 
Formato:
text; pdf
Idioma:
Español
Temas:
Biología / Epigenética - CELULAS MADRE EMBRIONARIAS - CELULAS MADRE PLURIPOTENTES INDUCIDAS - AUTO-RENOVACION - PLURIPOTENCIA - ARGININA METILTRANSFERASAS - EPIGENETICA
Descripción:
Las células madre embrionarias (ESCs) son células derivadas del macizo celular interno (ICM) del blastocisto. Poseen la capacidad de auto-renovarse indefinidamente en cultivo y de dar origen a células de las tres capas germinales, propiedad conocida como pluripotencia. Existen tres factores de transcripción fundamentales para la regulación génica de las células madre pluripotentes, Oct4, SOX2 y Nanog. Estudios de inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) han revelado que estos factores ocupan al mismo tiempo las regiones promotoras de diversos genes a lo largo de todo el genoma, sugiriendo que estos factores actúan como el núcleo de una red regulatoria que modula la expresión de genes involucrados en la diferenciación celular. Mientras que in vitro las ESCs pueden ser mantenidas indefinidamente en estado indiferenciado, in vivo, conforme progresa el desarrollo, las células del ICM abandonan su estado pluripotente para seguir diversos programas de diferenciación. El inicio de dichos programas depende, en gran medida, de la regulación de la expresión de genes tejidoespecíficos. Sin embargo, entender cuáles son estos genes y cómo son regulados no es suficiente para explicar el comienzo del proceso de diferenciación celular. Existen además, cambios en la organización de la cromatina a nivel global y de loci específicos, registrándose múltiples evidencias que relacionan la estructura de la cromatina de los genes marcadores de estadio indiferenciado con el mantenimiento de la pluripotencia. Nuestra hipótesis postula que existiría una relación bidireccional entre los niveles y la actividad de proteínas que remodelan la cromatina y de los factores de transcripción críticos en el mantenimiento de las propiedades de las células pluripotentes. El objetivo general de este trabajo es contribuir al esclarecimiento de la regulación epigenética que ocurre en las ESCs durante la diferenciación y el estado epigenético de éstas cuando son mantenidas en estado indiferenciado. Para ello, nos propusimos, en primer lugar analizar el patrón de expresión de proteínas modificadoras de la cromatina en ESCs indiferenciadas y en distintos estadios de diferenciación. Luego, una vez detectados genes de interés,evaluar el efecto de la modificación de sus niveles de expresión sobre el mantenimiento del estado indiferenciado y en la diferenciación de las ESCs. Por último, nos propusimos estudiar si los factores de transcripción relevantes en la preservación de la pluripotencia regulan la expresión los genes en estudio. Para nuestro primer objetivo, analizamos la expresión de enzimas relacionadas con el remodelado de la cromatina mediante RT-qPCR en ESCs indiferenciadas y las comparamos con la de células terminalmente diferenciadas. Posteriormente, diferenciamos ESCs mediante un protocolo no dirigido y analizamos la expresión de estos genes lo largo del proceso de diferenciación. Esta búsqueda arrojó una serie de genes candidato que podrían tener un rol en el mantenimiento de las propiedades básicas de las ESCs. Posteriormente, elegimos uno de estos genes, la metiltransferasa Prmt8, para continuar nuestros estudios. Los otros genes que surgieron de este análisis forman parte de otros proyectos de tesis. Utilizando tanto un protocolo de diferenciación no dirigido como uno dirigido hacia linaje neural, comprobamos que el gen de Prmt8 se regula negativamente durante el proceso de diferenciación. Por otra parte, construimos una línea estable de mESCs que contiene en su genoma un shRNA inducible contra Prmt8. Probamos que al inducir este shRNA los niveles de mensajero de esta enzima disminuyen, y que esto en un principio no afecta la capacidad de autorenovación de las células. Mediante análisis de inmunofluorescencia estudiamos la presencia y localización de marcadores del estado indiferenciado. No encontramos diferencias sustanciales en los marcadores analizados al comparar las células cultivadas en presencia del inductor del shRNA con las células control. Por otro lado, diferenciamos la línea que sub-expresa Prmt8 y encontramos que estas células parecen diferenciarse de forma diferente al control. Por último, analizamos si la expresión forzada de los factores de transcripción de pluripotencia modula la expresión de Prmt8 en un sistema heterólogo. En conjunto los datos sugieren que Prmt8 es regulado positivamente por los factores de transcripción de pluripotencia, y modulado durante la diferenciación, hecho que podría ser clave en la determinación del tipo celular de destino. En el futuro planeamos realizar estudios de inmunoprecipitación de la cromatina para estudiar la interacción de estos factores con el promotor de Prmt8. Por otra parte, nos interesa estudiar con mayor profundidad si la presencia de esta metiltransferasa es vital para la diferenciación hacia algún tipo celular en particular. Creemos que los conocimientos generados en el campo de la epigenética de células madre pueden contribuir a plantear estrategias que ayuden, en un futuro, a diseñar nuevas terapias celulares.
Identificador:
http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_5297_Luzzani
Identificador único:
http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/h/2579
Derechos:
info:eu-repo/semantics/openAccess
http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.5/ar/
Licencia de uso:
Licencia Creative Commons

Descargar texto: Tesis_5297_Luzzani.oai

Cita bibliográfica:

Luzzani, Carlos Daniel  (2013-03-26).     Estudio de la regulación de la expresión y de la relevancia de la metiltransferasa PRMT8 en células madre pluripotentes.  (Tesis Doctoral).    Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.    [consultado:  ] Disponible en el Repositorio Digital Institucional de la Universidad de Buenos Aires:  <http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_5297_Luzzani>