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Marcadores genéticos ligados al gen del factor VIII de coagulación : Su utilidad diagnóstica en hemofilia y en el estudio del mecanismo molecular de la recombinación homóloga en meiosis humanas


Genetic markers linked to the coagulation factor VIII gene. : Their utility for molecular diagnosis in haemophilia a and for the study of the molecular mechanism of homologous recombination in human meiosis.

De Brasi, Carlos Daniel

Director(a):
Larripa, Irene Beatriz
 
Institución otorgante:
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Fecha:
2001
Tipo de documento: 
Tesis Doctoral
 
Formato:
text; pdf
Idioma:
Español
Temas:
Biología / Biomedicina - Biología / Genética
Descripción:
La hemofiliaA (HA)es una enfermedad hemorrágica hereditaria, ligada al sexo, causada por deficiencia del factor VIIIde coagulación (FVIII). La ruta preferida para la provisión de datos para diagnóstico molecular es la detección directa de mutaciones. Entre las mutaciones que afectan al gen del FVIII, la inversión del intrón 22 (inv22) constituye la causa de casi la mitad de las HA severas (SHA). Mediante análisis de Southern blot fueron estudiadas 47 familias Argentinas con SHA. En cercano acuerdo a lo reportado series internacionales, 19 de ellas (40%) resultaron informativas para la Inv22 y pudo proveerse diagnóstico molecular por el método directo. Dentro de éstas, 14 (79%) resultaron Inv22 tipo distal y las restantes 5 (21%), proximal. No fueron encontradas significativas asociaciones entre la presencia o no de la Inv22 en SHA, y el origen de la enfermedad (esporádica o familiar), ni tampoco con la propensión o no a desarrollar anticuerpo inhibidor neutralizante contra el FVIII terapéutico. El camino alternativo para el diagnóstico es por vía indirecta usando polimorfismos ligados a la enfermedad. Entre los polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) ubicados dentro del gen del FVIII, el marcador Xbal A del intrón 22 a pesar de proveer una alta informatividad en los distintos ganos étnicos analizados, fue casi excluido de la rutina diagnóstica por la lentitud y laboriosidad de su detección. Aquí se describen dos métodos rápidos, no-radioactivos, basados en PCR de larga distancia (LDPCR), para genotipificación del RFLP Xbal A. Los amplimeros de 6,6 y 6,9 kb incluyen el sitio polimórfico y un sitio constante de Xbal que provee control de digestión. La especificidad del método fue desafiada en experimentos a ciegas de muestras previamente genotipificadas por Southern blot, obteniéndose una perfecta correlación entre ambos métodos. Mediante este método, 53 cromosomas X de la población Argentina general fueron genotipificados para Xbal A, lo que permitió proyectar una informatividad de aproximadamente el 47%. Los estudios de asociaciones alélicas entre Xbal A (X) y el polimorfismo Bc/l (B) del intrón 18 del gen del FVIII, determinaron un alto, pero no-completo desequilibrio de ligamiento entre los marcadores, proyectando una informatividad combinada (X+B) del 55%. A 737 bp rio abajo del RFLP Xbal, fue localizado y caracterizado un nuevo polimorfismo bialélico, de cambio de nucleótido que afecta el sitio de reconocimiento de la enzima Mspl (CCg/aG). La genotipificación especifica del RFLP Mspl A se realiza utilizando la LD PCR específica para Xbal A como primera vuelta. seguida por una PCR anidada de 176 bp que incluye al sitio polimórfico y uno constante de Mspl para proveer control de digestión. Su análisis en las poblaciones nomiales Argentina y Británica permitió estimar una heterocigocidad de 49 y 46%, respectivamente. A pesar de su proximidad física y su desequilibrio de ligamiento, X y M proyectan una informatividad conjunta del 62% para población Argentina y 59% para la Británica. Ambos RFLPs (X y M) están incluídos en una región de 9,5 kb dentro del intrón 22 del gen del FVIII(int22h-1), que se encuentra repetida por lo menos 2 veces fuera del gen del FVIII, también sobre Xq28 (int22h-2 y -3). Para investigar los sitios correspondientes de X y M sobre los homólogos extragénicos fueron diseñados abordajes específicos similares a aquellos usados para los sitios intragénicos. Los sitios Mspl extragénicos (B y C) resultaron polimórficos en población Argentina y Británica aunque con frecuencias del alelo [+] mucho menores a las intragénicas. La Inv22 es originada por un evento de entrecruzamiento recíproco intracromosómico por recombinación homóloga entre las secuencias int22h descriptas resultando en la interrupción inactivante del gen del FVIII en su intrón 22. Debido a (1) que los marcadores X y M ubicados dentro de int22h permiten mediante sus frecuencias alélicas diferenciar las copias intra de las extragénicas y (2) que en el cromosoma X de varones de la población normal podemos estimar el estado de estos marcadores antes del evento y en los hemofílicos con la Inv22 podemos analizar el estado de estos marcadores después del evento; se diseño una estrategia para recabar datos del mecanismo molecular que origina la Inv22 como modelo de entrecruzamiento recíproco en meiosis humanas. La aplicación del método planteando nueve hipótesis de posibles intermediarios moleculares de la Inv22 asociadas a la predicción de resultados numéricos utilizando las estimaciones sobre población de varones normales y su comparación con los datos obtenidos en el grupo de afectados con la Inv22, permitió determinar que el evento molecular de recombinación meiótica está acoplado a la conversión génica del marcador Xbal, con la secuencia extragénica como dadora de la información. El mismo análisis sobre Mspl si bien proyecta resultados similares, no permite determinado con significación estadística. El aumento de la población hemofílica para la obtención de resultados más precisos además de los estudios de mapeo de puntos calientes para rupturas meióticas de doble cadena dentro de las secuencias int22h permitirá la elucidación específica del mecanismo de la Inv22 como modelo de recombinación homóloga en meiosis humanas.
Identificador:
http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3380_DeBrasi
Identificador único:
http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/h/3539
Derechos:
info:eu-repo/semantics/openAccess
http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.5/ar/
Licencia de uso:
Licencia Creative Commons

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Cita bibliográfica:

De Brasi, Carlos Daniel  (2001).     Marcadores genéticos ligados al gen del factor VIII de coagulación : Su utilidad diagnóstica en hemofilia y en el estudio del mecanismo molecular de la recombinación homóloga en meiosis humanas.  (Tesis Doctoral).    Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.    [consultado:  ] Disponible en el Repositorio Digital Institucional de la Universidad de Buenos Aires:  <http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3380_DeBrasi>