untitled

Institución otorgante:
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires
Fecha:
1999
Tipo de documento: 
Tesis Doctoral
 
Formato:
text; pdf
Idioma:
Español
Temas:
Biología / Ingeniería Genética - Biología / Biología Molecular y Celular
Descripción:
Durante este trabajo se estudio la regulación tejido especifica de dos genes mediante la utilización de ratones transgénicos. l) Se estudio con que eficacia un fragmento de 3,8 kb del promotor bovino de β-caseina puede dirigir una expresión tejido especifica a la glándula mamaria. El patrón de expresión espacial, temporal y hormonal del gen de fusión, resultó altamente regulado y confinado estrictamente a celulas epiteliales de la glándula mamaria lactante. En estudios previos realizados sobre una línea celualar de glándula mamaria de ratón, se había demostrado que con 1,7 kb del promotor bovino de β-caseína era posible obtener expresión celular específica, a su vez regulada hormonalmente. Esta misma construcción no funcionó al intentar dirigir la expresión específica a glándula mamaria de ratones transgénicos. En este trabajo utilizamos un promotor de mayor tamaño del mismo gen, 3.8 kb, para direccionar la expresión del gen de la hormona de crecimiento humana (hGH) a glándula mamaria de ratones transgénicos. Por medio de un ensayo de Northern blot se determinó la presencia de ARNm de hGH únicamente en glándula mamaria de hembras en período de lactancia. Este ARNm no se detectó en glándula mamaria de hembras vírgenes. Un análisis durante el desarrollo de la glándula mamaria demostró que el transgén sigue un patrón de expresión que se asemeja mucho más al bovino que al murino. En estudios de hibridización in situ, realizados sobre secciones de glándula mamaria, se observó que el patrón de expresión del transgén resultó homogeneo en todos los lóbulos, tanto en animales heterocigotas como homocigotas. La cantidad de granos de plata contados sobre tejido mamario se correlacionó áltamente con el contenido de hGH en leche, previamente determinado por radioinmunoensayo (r=0 996). Por lo tanto, las 3,8 kb del promotor bovino de β-caseína pueden direccionar altos niveles de expresión de proteínas terapéuticas a la glándula mamaria de ratones transgénicos con especificidad celular y regulación correcta durante el desarrollo. 2) Se evaluó la expresión celular especifica del gen de Pro-Opiomelanocortin (POMC) en neuronas. El gen de POMC se expresa en una serie de neuronas del hipotálamo y tracto solitario, y en corticotrofos y melanotrofos hipofisarios. En estudios previos se determinó que una porción proximal del promotor de POMC de rata o ratón era suficiente para dirigir expresión celula-específica, regulada hormonalmente y en forma correcta durante el desarrollo, a melenotrofos y corticotrofos, pero no a neuronas. Más recientemente se identificó la presencia de posibles activadores de la transcripción dentro de una zona de 11 kb en la región 5’flanqueante del gen de POMC (entre —13kb y —2kb). En el presente trabajo, por medio de un análisis delecional se ubicó el elemento neuronal específico a una resolución de 4 kb. Se generaron 3 construcciones conteniendo secuencias genómicas de POMC (6 kb de la unidad transcripcional y 2 kb de la región 3’flanqueante) con diferentes longitudes de la región 5’flanqueante, 13 kb (-13/+8POMC-EGFP), 9 kb (—9/+8POMC-EGFP) y 5 kb (-5/+8POMC-EGFP). A estas secuencias se les introdujo en el exón 2, previo al sitio ATG, una versión mamiferizada de la proteína verde fluorescente de medusa (EGFP). Esta innovación permitió visualizar la expresión transgénica en el cerebro e hipófisis en forma inmediata luego de realizar los cortes de los tejidos. En tres de un total de cuatro lineas de animales transgénicos generados para las construcciones -5/+8POMC-EGFP y -9/+8POMC-EGFP se observó fluorescencia en corticotropos y melanotropos. Estos transgenes se expresaron en neuronas. Contrariamente, la construccion -13/+8POMC-EGFP se expresó correctamente en hipófisis y neuronas de POMC Este resultado nos sugiere que la presencia del elemento neuronal específico buscado se encuentra entre —9 y —l3kb del inicio de la transcripción. En experimentos futuros, nuestro objetivo será clonar e identificar el factor de transcripción neuronal que interactúa con los elementos en cis. Nosotros proponemos inmortalizar un linea celular neuronal que exprese POMC mediante oncogénesis dirigida en ratones transgénicos. Hemos generado 4 lienas de ratones transgénicos con una construcción similar a —l3/+8POMC-EGFP, pero conteniendo una versión termo-sensible del antígeno T largo (AgT-tsA58) insertada en el segundo exón del gen de POMC de ratón. En estas 4 líneas se desarrollaron tumores prematuramente en la región hipofisaria-lúpotalámica, a pesar de que la temperatura corporal del ratón es no permisiva. Tres de estos ratones murieron antes de reporoducirse. Sólo una líena pudo ser mantenida con un programa de aparcamientos utilizando machos jóvenes. En estudio realizado con un Northern blot se observó una expresión considerable de POMC en esos tumores. En próximos experimentos evaluaremos la prsencia de marcadores neuronales e hipofisafios para determinar la naturaleza de dichos tumores.
Identificador:
http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3150_Cerdan
Identificador único:
http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/h/4302
Derechos:
info:eu-repo/semantics/openAccess
http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.5/ar/
Licencia de uso:
Licencia Creative Commons

Descargar texto: Tesis_3150_Cerdan.oai

Cita bibliográfica:

Cerdán, Marcelo Guido  (1999).     Especificidad tisular de la expresión de genes Eucariotas en ratones transgénicos : 1) 3,8 kilobases del promotor de beta-caseína bovino dirigen la expresión de proteínas recombinantes a la glándula mamaria y 2) expresión específica del gen de proopiomelanocortina en el sistema nervioso central.  (Tesis Doctoral).    Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.    [consultado:  ] Disponible en el Repositorio Digital Institucional de la Universidad de Buenos Aires:  <http://digital.bl.fcen.uba.ar/gsdl-282/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=tesis&d=Tesis_3150_Cerdan>